格列喹酮促進(jìn)C2C12細(xì)胞攝取葡萄糖

1 引言
　　胰島素抵抗和β細(xì)胞功能缺陷是2 型糖尿病特征性病理生理學(xué)改變，其中胰島素抵抗是2 型糖尿病的發(fā)病機(jī)制中一重要環(huán)節(jié)，胰島素抵抗主要表現(xiàn)之一為胰島素敏感組織(肌肉、脂肪組織)葡萄糖攝取減少。格列喹酮作為第二代磺脲類藥物，其主要作用是通過(guò)促進(jìn)胰島素分泌而控制血糖。隨著學(xué)者們對(duì)磺脲類藥物作用機(jī)理研究的深入，格列喹酮經(jīng)典途徑以外的降糖機(jī)制也逐漸引起大家的關(guān)注。Rinninger F 等[i]研究發(fā)現(xiàn)，格列喹酮可通過(guò)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的肝臟細(xì)胞糖原合成增加而發(fā)揮胰腺外作用，Marco 等[ii]研究發(fā)現(xiàn)格列喹酮可誘導(dǎo)3T3-L1成纖維細(xì)胞PPARγ 靶基因GLUT4 的表達(dá)，其作用效應(yīng)與吡格列酮相近。本研究旨在通過(guò)體外葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)，觀察格列喹酮對(duì)C2C12 細(xì)胞葡萄糖攝取作用及對(duì)胰島素刺激的糖攝取的影響，并初步探討格列喹酮的胰腺外降糖作用機(jī)制，為進(jìn)一步闡明其臨床作用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　2 材料與方法
　　2.1 材料
　　2.1.1 細(xì)胞株
　　小鼠成肌細(xì)胞株(C2C12) ,由德國(guó)烏爾姆大學(xué)劉躍飛教授惠贈(zèng)。
　　2.1.2 主要試劑
　　DMEM 培養(yǎng)基（Gibco 產(chǎn)品，高糖型），胎牛血清（杭州四季青公司），馬血清（Gibco產(chǎn)品），胰蛋白酶、DEPC、溴化乙錠（Sigma 公司），Trizol（Invitrogen 公司），逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 酶、Taq 酶（MBI 公司），GLUT4 及β-actin 引物由上海生工合成，100 bp LadderDNA Marker (Axyden 公司)，瓊脂糖（Gibco 公司），3H -2-脫氧葡萄糖（Amersham 產(chǎn)品），格列喹酮（北京萬(wàn)輝雙鶴藥業(yè)），其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
　　2.2 方法
　　2.2.1 C2C12 的培養(yǎng)
　　加入含 10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置于37℃、含5％CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70％~80％融合時(shí)按1：4 傳代。
　　2.2.2 C2C12 誘導(dǎo)分化
　　C2C12 細(xì)胞達(dá)80%左右融合時(shí)，傳代接種于干預(yù)板中，待生長(zhǎng)至80%~90%融合時(shí)，換用分化培養(yǎng)基（含2%馬血清的DMEM 培養(yǎng)基）誘導(dǎo)分化(day0)，每24 小時(shí)換液一次；5-7天后90%以上成為成熟骨骼肌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　2.2.3 葡萄糖氧化酶法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖水平
　　細(xì)胞接種于 6 孔板，給藥組在細(xì)胞分化后分別加入含10-5mol/L 的格列喹酮、10-7mol/L胰島素以及10-5mol/L 格列喹酮+10-7mol/L 胰島素的DMEM，同時(shí)設(shè)立空白組、不含細(xì)胞的DMEM 組。溫育12 h 后再將培養(yǎng)基移出并用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)培養(yǎng)基中的含糖量。用DMEM 組含糖量的平均值減去其余各孔的含糖量，即是12h 各孔細(xì)胞的葡萄糖消耗量。收集細(xì)胞提取總RNA。
　　2.2.4 采用四甲基偶氮唑鹽法評(píng)估格列喹酮對(duì)C2C12 細(xì)胞增殖的影響
　　取體外培養(yǎng)的C2C12 細(xì)胞，0.25%的胰酶溶液消化，制成單細(xì)胞懸液，1000 r/min 離心5min，以含10％胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞懸液密度為3.4×106 /L，接種至96 孔板，200μL/孔。實(shí)驗(yàn)共分4 組：空白對(duì)照組、10-7mol/L 胰島素組、10-5mol/L 格列喹酮組、格列喹酮+胰島素組，6 個(gè)平行孔/組。各組在37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合率達(dá)80%且未出現(xiàn)細(xì)胞分化時(shí)，藥物組分別向C2C12細(xì)胞中加入含對(duì)應(yīng)濃度藥物的無(wú)血清培養(yǎng)基，空白對(duì)照組則向C2C12 細(xì)胞中加入單純無(wú)血清培養(yǎng)基。各組細(xì)胞干預(yù)12 h 后進(jìn)行四甲基偶氮唑鹽檢測(cè)。即每孔加入5mg/mL 的四甲基偶氮唑鹽液20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，鏡下可見(jiàn)紫藍(lán)色針狀結(jié)晶。吸出孔內(nèi)培養(yǎng)基后，每孔加入二甲基亞砜200μL，室溫下將平板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，待結(jié)晶物溶解后，置于酶聯(lián)免疫儀于490 nm 處檢測(cè)各孔吸光度值。
　　2.2.5 3H -2-脫氧葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)
　　細(xì)胞接種于 24 孔板，給藥組在細(xì)胞分化后分別加入含 10-5mol/L 的格列喹酮、10-5mol/L格列本脲的DMEM，同時(shí)設(shè)立空白組。用KRP 緩沖液洗滌3 次后，加入含10-7mol/L 胰島素的KRP 緩沖液，在37℃繼續(xù)培養(yǎng)30min，然后加入3H -2-脫氧葡萄糖，使終濃度為3.7×104Bq/L，作用15 min 后，用冷PBS 洗滌3 次，用0.1mol/L 的NaOH 裂解細(xì)胞，取細(xì)胞裂解液用液閃儀計(jì)數(shù)其每分鐘計(jì)數(shù)(CPM)。每一樣本測(cè)定的CPM 值用與對(duì)照組的比例表示。
　　2.2.6 RT-PCR 法檢測(cè)GLUT4 mRNA 表達(dá)
　　采用 Trizol 一步法提取各組細(xì)胞的總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 的A260nm 與A280nm 比值在1.60～1.90 之間。取4μl 總RNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)文獻(xiàn)，并與從Gene Bank上下載的人GLUT4 mRNA、β-actin mRNA 核苷酸序列核對(duì)，由上海生工合成GLUT4 和β-actin 單核酸引物。GLUT4 上游: 5’- gcccgaaagagtctaaagcg -3’ ， 下游: 5’-actaagagcaccgagaccaa-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)312bp。β-actin 上游:5’- cgtgcgtgacattaaagag -3’，下游: 5’-ctggaaggtggacagtgag- 3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)435bp。擴(kuò)增條件: 95℃ 5min 預(yù)變性，然后95℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 45s 進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，再以72℃延伸10min，再以72℃延伸10min。反應(yīng)完成后取5μl PCR 產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠（含0.5mg/ L 溴化乙錠）電泳，用Sensicapture 自動(dòng)凝膠成像分析儀掃描凝膠圖譜，LabImage 分析軟件對(duì)RNA 條帶進(jìn)行分析，得出GLUT4 與內(nèi)參照條帶β-actin 的吸光度比值，比較各組GLUT4mRNA 相對(duì)表達(dá)情況。
　　2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　應(yīng)用 SPSS 13.0 軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)都用?x±s 表示，采用one-wayANOVA 進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，組間比較采用S-N-K 檢驗(yàn)，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3 結(jié)果
　　3.1 格列喹酮對(duì)C2C12 細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖消耗的影響
　　結(jié)果顯示，干預(yù)12h 后，胰島素組C2C12 細(xì)胞葡萄糖消耗量明顯增加，高于空白組（12.34±0.55 vs 7.86±0.63，P<0.01），格列喹酮組細(xì)胞耗糖量亦明顯增加（10.95±0.46 vs 7.86±0.63，P<0.01），格列喹酮+胰島素組細(xì)胞耗糖量較胰島素組增多（13.77±0.73 vs 12.34±0.55，P<0.01）。
　　3.2 格列喹酮對(duì)C2C12 細(xì)胞增殖的影響
　　四甲基偶氮唑鹽檢測(cè)結(jié)果表明，細(xì)胞處理12 h 后，與空白組比較, 胰島素組、格列喹酮+胰島素組平均吸光度值均顯著增加（0.74±0.09，0.76±0.09 vs 0.54±0.06，P<0.01），而格列喹酮組平均吸光度值無(wú)明顯變化（0.55±0.089 vs 0.52±0.063，P>0.05）。
　　3.3 格列喹酮對(duì)C2C12 細(xì)胞葡萄糖攝取的影響
　　C2C12 細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下對(duì)葡萄糖有一定的攝取，胰島素刺激可使細(xì)胞葡萄糖攝取增加（為空白組的1.68±0.09 倍，P<0.01）；10-5mol/L 的格列喹酮、10-5mol/L 格列本脲孵育細(xì)胞12h 后，與空白組相比，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取均增加（分別為1.52±0.23 倍、1.23±0.16 倍，P<0.01）；與格列苯脲相比，格列喹酮組細(xì)胞葡萄糖攝取增高更明顯（P<0.01）；在胰島素存在的情況下，格列喹酮組細(xì)胞葡萄糖攝取明顯增加（為空白組的1.93±0.12 倍，P<0.01），且高于胰島素組（P<0.01），見(jiàn)格列喹酮對(duì)C2C12 細(xì)胞葡萄糖攝取的影響。
　　3.4 格列喹酮對(duì)C2C12 細(xì)胞GLUT4 mRNA 表達(dá)的影響
　　胰島素和格列喹酮干預(yù)C2C12 細(xì)胞12 小時(shí)結(jié)果顯示，胰島素組GLUT4 mRNA 表達(dá)高于空白組（0.73±0.04 vs 0.47±0.02，P<0.01），格列喹酮組GLUT4 mRNA 表達(dá)與空白組相比無(wú)明顯差異（0.50±0.02 vs 0.47±0.02，P>0.05），格列喹酮+胰島素組與胰島素組相比無(wú)明顯差異（0.50±0.03 vs 0.50±0.02，P>0.05）。
　　4 討論
　　格列喹酮作為第二代磺脲類藥物，其主要作用是通過(guò)促進(jìn)胰島素分泌和增強(qiáng)胰島素的外周作用來(lái)控制血糖，此外，它還具有廣泛的胰腺外作用。Yarat 等[iii]研究顯示，格列喹酮可顯著減少糖尿病大鼠晶狀體內(nèi)非酶糖基化蛋白及總蛋白水平，顯著增加谷胱甘肽水平。
　　Yanardag 等[iv]發(fā)現(xiàn)格列喹酮對(duì)糖尿病大鼠的肝臟損傷有保護(hù)效應(yīng)。另有研究顯示，格列喹酮能抑制糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的人腎系膜細(xì)胞（HRMC）正常 T 細(xì)胞表達(dá)分泌的調(diào)節(jié)活化蛋白（RANTES）的表達(dá)和分泌[v]，提示格列喹酮可降低具有較強(qiáng)趨化炎癥細(xì)胞作用的RANTES水平從而可能在糖尿病腎病的防治中發(fā)揮一定的作用。
　　胰島素抵抗是2 型糖尿病發(fā)病機(jī)制中一重要環(huán)節(jié)，經(jīng)典定義是指需要超過(guò)正常量的胰島素才能在胰島素的效應(yīng)器官產(chǎn)生正常生理效應(yīng)，現(xiàn)代的胰島素抵抗概念則泛指胰島素促進(jìn)周圍組織攝取和利用葡萄糖的作用減低[vi]。骨骼肌占人體重的40%以上，是胰島素刺激狀態(tài)下攝取葡萄糖和代謝葡萄糖的最主要組織之一，在體內(nèi)糖代謝平衡中發(fā)揮重要作用。葡萄糖是一種極性分子，不能以自由擴(kuò)散的方式通過(guò)細(xì)胞膜，絕大多數(shù)組織細(xì)胞都必須借助細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLUTs），通過(guò)易化擴(kuò)散的方式攝入葡萄糖。GLUTs 有多種亞型，其中GLUT1 主要分布于腦部血管內(nèi)皮細(xì)胞(包括血腦屏障)和紅細(xì)胞膜上，也低水平表達(dá)于脂肪組織、肌肉和肝臟，這種廣泛表達(dá)的GLUT1 為許多細(xì)胞提供基礎(chǔ)狀態(tài)下的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　GLUT4 是存在于骨骼肌、脂肪組織中轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的載體，它的表達(dá)和功能的改變可能涉及肌肉和脂肪細(xì)胞胰島素抵抗[vii，viii，ix]。
　　本實(shí)驗(yàn)選用源于小鼠的成肌細(xì)胞株C2C12，通過(guò)馬血清誘導(dǎo)其退出細(xì)胞增殖周期，促進(jìn)其分化為成熟骨骼肌細(xì)胞[x]。采用葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)，觀察在格列喹酮處理下培養(yǎng)基中葡萄糖消耗程度，可以直觀地反映該藥物對(duì)骨骼肌細(xì)胞糖代謝的影響。結(jié)果顯示：在無(wú)胰島素存在的情況下，格列喹酮能增加C2C12 細(xì)胞耗糖量，但未見(jiàn)其對(duì)細(xì)胞活力有影響，提示這種耗糖量的增加并不是因?yàn)榧?xì)胞活力變化引起的，從而認(rèn)為可能是葡萄糖攝取增多的結(jié)果；聯(lián)用胰島素和格列喹酮進(jìn)行處理時(shí)，呈現(xiàn)明顯的協(xié)同降糖作用。鑒于葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)觀察的是細(xì)胞在一段時(shí)間內(nèi)消耗葡萄糖的總和，在這段相對(duì)“漫長(zhǎng)”的時(shí)間內(nèi)，除了GLUT4 之外，骨骼肌細(xì)胞中存在的其他的一些非胰島素敏感的、轉(zhuǎn)運(yùn)速度緩慢而持久的GLUT1 等載體對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)作用可能都疊加在一起。而葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)觀察的是在短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞對(duì)同位素標(biāo)記的脫氧葡萄糖的攝取，考察的是格列喹酮對(duì)細(xì)胞快速攝取葡萄糖能力的影響，對(duì)于骨骼肌和脂肪等胰島素敏感細(xì)胞，主要反映的是對(duì)GLUT4 功能的影響。結(jié)果顯示，C2C12 細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下對(duì)葡萄糖有一定的攝取，但在胰島素刺激以后，增加倍數(shù)不明顯，10-7mol/L 的胰島素刺激下糖攝取能力增加也不到2 倍，這與文獻(xiàn)報(bào)道的C2C12 細(xì)胞系的GLUT4 表達(dá)量相對(duì)不足相一致，即使分化融合為肌管后對(duì)胰島素的反應(yīng)性也較差[xi，xii]。實(shí)驗(yàn)觀察到格列喹酮干預(yù)C2C12 細(xì)胞12h 后表現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞糖攝取的效應(yīng)，且能增強(qiáng)胰島素依賴的葡萄糖攝取作用，與葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。
　　胰島素和肌肉收縮被認(rèn)為是調(diào)節(jié)骨骼肌糖代謝的主要生理因素，且兩者的作用有協(xié)同性[xiii]。一般認(rèn)為可從三方面來(lái)調(diào)節(jié) GLUT4 的功能，增加骨骼肌對(duì)葡萄糖的攝取。首先可通過(guò)上調(diào) GLUT4 蛋白的含量，可能的機(jī)制是促進(jìn) GLUT4 的基因表達(dá)和蛋白合成，或減少其降解，或是兩者兼有；其次是通過(guò)增加 GLUT4 的轉(zhuǎn)位，使細(xì)胞膜上的 GLUT4 增多，從而促進(jìn)葡萄糖的攝��；還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上的 GLUT4 內(nèi)在活性，這可能是通過(guò)直接調(diào)節(jié)GLUT4 本身或通過(guò)與其他調(diào)節(jié)分子相互作用而實(shí)現(xiàn)的[xiv]。本研究結(jié)果顯示格列喹酮能促進(jìn)C2C12 細(xì)胞葡萄糖攝取，但并未發(fā)現(xiàn)其增加細(xì)胞GLUT4 基因表達(dá)，推測(cè)其促細(xì)胞攝取葡萄糖的作用可能存在其它機(jī)制，如對(duì)GLUT4 翻譯水平的正向調(diào)節(jié)作用、增加GLUT4轉(zhuǎn)位或增強(qiáng)其內(nèi)在活性等。因此格列喹酮對(duì)GLUT4 的作用還有待于進(jìn)一步研究。
　　5 總結(jié)
　　本研究表明格列喹酮能促進(jìn)小鼠骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取，且可增加胰島素介導(dǎo)的葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，提示格列喹酮可能改善胰島素的敏感性。細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取是一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，關(guān)于格列喹酮刺激糖吸收的機(jī)制以及與胰島素信號(hào)通路中其它因子的關(guān)系，尚待進(jìn)一步的研究。

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