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抗腫瘤藥氯法拉濱的致突變性及溶血性研究
【摘要】 目的 了解氯法拉濱(簡稱CLO)對骨髓紅細(xì)胞和雄性小鼠生殖細(xì)胞有無致突變和致畸作用，以及對外周血紅細(xì)胞有無溶解作用。方法 采用微核試驗檢測CLO對骨髓RBC的致突變性，采用精子畸變試驗檢測CLO對小鼠生殖細(xì)胞的致畸作用，采用人紅細(xì)胞檢測CLO的溶血性。結(jié)果 經(jīng)微核試驗，CLO測試組與陽性對照組兩組間差異無顯著性(P>0.01)，與陰性對照組間差異有顯著性(P<0.05)。精子畸變試驗中，CLO測試組與陽性對照組之間差異無顯著性(P>0.05)，而與陰性對照組之間差異有顯著性(P<0.01)。CLO在體外各時段不致人紅細(xì)胞溶解。結(jié)論 經(jīng)檢測，CLO同其他抗癌核苷酸類似藥一樣，可以引起體內(nèi)增殖活性強(qiáng)的細(xì)胞的突變，以及生殖細(xì)胞的畸變;對人紅細(xì)胞的溶解性為陰性。
【關(guān)鍵詞】 氯法拉濱;微核試驗;精子畸變試驗;溶血性;致畸;致突變
多數(shù)抗白血病藥物的藥理作用是以抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成以及抑制某些聚合酶的作用從而阻止腫瘤細(xì)胞增殖為特征。所以，世界衛(wèi)生組織(WHO)曾宣布：從DNA入手才是治療腫瘤的關(guān)鍵。氯法拉濱(簡稱CLO)即是如此，作為一種核苷酸還原酶抑制劑，可以使腫瘤細(xì)胞DNA合成終止達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[1]，那么對正常機(jī)體的生殖細(xì)胞、骨髓紅細(xì)胞及外周血紅細(xì)胞的影響是怎樣的呢?我們即對此進(jìn)行了研究。本研究是以小白鼠和體外人紅細(xì)胞為實驗對象來了解CLO對它們的反應(yīng)性。應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法，為評價CLO對生殖細(xì)胞畸變，對骨髓紅細(xì)胞致突變作用的影響規(guī)律，以及對人紅細(xì)胞的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
1 實驗材料
1.1 藥品與試劑 CLO制劑：某兄弟院校贈予。陽性對照物：環(huán)磷酰胺，山西普德藥業(yè)有限公司，批號20070302。陰性對照物：生理鹽水。Giemsa染液。pH6.8磷酸鹽緩沖液。
1.2 實驗儀器 醫(yī)用離心機(jī)：TL80-1型，中國姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司。 恒溫水浴箱：TL-420D型，天力醫(yī)療器械有限公司。顯微鏡：日本OLYMPAS株式會社出品，型號CX200。
1.3 動物 8～12周齡昆明種小白鼠100只，雄性75只，雌性25只，由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院新藥評價中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為：SCXK魯20030004。
2 實驗方法
2.1 微核試驗[2～4]
2.1.1 CLO試驗組 選用昆明種成年小鼠30只，雌雄各半，運(yùn)達(dá)本室后稱重標(biāo)記，體重23～27g。飼養(yǎng)1周，以觀察其健康狀況使其適應(yīng)本室環(huán)境，適當(dāng)控制飲食，1周內(nèi)使體重變化在4g左右。將CLO配成1mg/ml的濃度。給藥：小鼠按200mg/kg灌胃給藥，連續(xù)1周。骨髓涂片：第八天頸椎脫臼致死小鼠，解剖剪取胸骨;載玻片上滴加小牛血清，用止血鉗擠壓胸骨骨髓液點(diǎn)加于血清中�；靹�，推片，自然干燥后滴加甲醇覆蓋涂膜固定。染色：Giemsa染色，將固定好的涂片滴加Giemsa應(yīng)用液，根據(jù)室溫染色維持10～15min后，加2倍pH6.8磷酸鹽緩沖液，繼續(xù)染3～5min，用PBS沖洗，晾干。觀察計數(shù)：用雙盲法閱片，高倍鏡下觀察計數(shù)嗜多染紅細(xì)胞的微核發(fā)生率，每只動物計數(shù)1000個細(xì)胞。
2.1.2 陽性對照 小鼠10只，雌雄各半，飼養(yǎng)方法、條件同上。取針劑環(huán)磷酰胺200mg，加生理鹽水8ml，再作1：10稀釋，使之成為2.5mg/ml的濃度。每只小鼠按40mg/(kg·d)做腹腔注射，連續(xù)2天，間隔24h，末次注射后6h處死，取骨髓細(xì)胞方法、染色方法、觀察計數(shù)同CLO試驗組，計數(shù)陽性對照組的微核率。
2.1.3 陰性對照 取小鼠10只，雌雄各半，稱重后以0.4ml/(25g·d)的劑量以生理鹽水灌胃連續(xù)7天，計數(shù)微核率方法同上。
2.2 精子畸變試驗 此項試驗選用健康雄性小鼠，體重23～27g。
2.2.1 CLO試驗組 選用健康雄性昆明種小鼠30只，以CLO 20mg/kg灌胃給藥7天后，處死小鼠、摘除附睪，用生理鹽水將血液漂洗干凈，置小燒杯中，用剪刀將附睪縱向剪開，加生理鹽水1～1.5ml，用滴管反復(fù)適度吹打，使精子均勻散在液體中，靜置1min。取上層懸液1滴，加在干凈的載玻片上，蓋上蓋片，立即用高倍鏡觀察，檢查精子的頭部、體部和尾部的形態(tài)變化。以形態(tài)良好，游動活潑的精子為正常。以無頭、小頭、胖頭、雙頭、雙尾、無尾及無定形為精子畸形[3，5]，計數(shù)1000個精子的畸變率。
2.2.2 陽性對照試驗 取雄性小鼠10只，腹腔注射環(huán)磷酰胺40mg/kg[5]，相當(dāng)于體積劑量為0.4ml/(25g·d)，連續(xù)5天，取精子方法、計數(shù)精子畸變率法同試驗組。
2.2.3 陰性對照 取雄性小鼠10只，以0.4ml/(25g·d)的劑量做腹腔注射生理鹽水，連續(xù)7天，用藥時間、取精子方法、計數(shù)畸變率同試驗組。
2.3 溶血性試驗 CLO測試物溶液以1mg/ml為原液進(jìn)行稀釋。
2.3.1 試管設(shè)定 分設(shè)陽性對照、陰性對照試管各1支，測試管1～5號，共7支。
2.3.2 紅細(xì)胞懸液的制備 無菌抽取健康志愿者O型血5ml，置50ml無菌錐形瓶中用玻璃珠搖晃去除纖維蛋白，然后分取1/2移入2支10ml刻度離心管中，各加入生理鹽水5ml，混勻，離心1500rpm 10min，棄上清，洗2次。將所得紅細(xì)胞用生理鹽水稀釋成2%，備用[6]。
2.3.3 加樣 取試管7支，編號。按表1所示，分別加入各溶液。表1 溶血性試驗加樣表 (ml)
第6管不加CLO溶液，只加紅細(xì)胞溶液及生理鹽水作為陰性對照;第7管不加CLO溶液和生理鹽水，只加紅細(xì)胞溶液和蒸餾水作陽性對照。1～5管為測試管，加入不同體積的CLO溶液和不同體積的生理鹽水，使其成為遞減的終濃度。將各管置于試管架上輕輕搖勻，置37℃中進(jìn)行恒溫水浴4h，分不同時段觀察各管的溶血和凝集現(xiàn)象，必要時用顯微鏡觀察紅細(xì)胞是否完整。顯微鏡觀察方法：將試管輕輕搖勻，取溶液20μl，滴于載玻片上，蓋上蓋片，高倍鏡觀察細(xì)胞的有無及完整性。
3 實驗結(jié)果
3.1 微核試驗 小鼠骨髓片經(jīng)Giemsa染色后進(jìn)行閱片，選擇細(xì)胞完整、分布均勻，著色適度的區(qū)域，用高倍鏡觀察[1]。鏡下：嗜多染紅細(xì)胞呈灰白色，因成熟紅細(xì)胞核糖體消失，被染成淡桔紅色，微核大多情況下呈單個圓形，邊緣光滑整齊，游離于細(xì)胞質(zhì)中，嗜色性與核質(zhì)相一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色，直徑通常為紅細(xì)胞的1/20～1/5，故稱為微核。CLO測試物與陽性對照、陰性對照的微核發(fā)生率及其對照如表2所示。表2 CLO微核率與陽性對照、陰性對照實驗結(jié)果
注：*CLO測試組與陽性對照,陰性對照的比較結(jié)果 CLO測試物與陽性對照和陰性對照的關(guān)系分析：采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(〖x〗±SD)表示。經(jīng)分析表明，CLO測試組與陽性對照組兩者之間差異無顯著性(P>0.01)，CLO測試組與陰性對照比較差異有顯著性(P<0.05)。因此推斷，抗癌新藥CLO對骨髓紅細(xì)胞有一定的致突變作用。
3.2 精子畸變試驗 高倍鏡觀察：每只小鼠計數(shù)1000個精子，分計出正常與異常精子。統(tǒng)計學(xué)處理：使用SPSS13.0軟件對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗，組間比較用χ2分割法。結(jié)果見表3。表3 CLO精子畸變與陽性對照、陰性對照實驗結(jié)果及比較
結(jié)果表明：精子畸變試驗中，CLO測試組與陽性對照組差異無顯著性(P>0.05)，而與陰性對照組差異有顯著性(P<0.01)。因此，CLO對雄性昆明種小鼠有誘導(dǎo)遺傳突變、精子致畸作用。
3.3 溶血性試驗 在37℃水浴中，每隔15min觀察1次，4次后每隔1h觀察1次，共7次，有疑問者取20μl做壓片，顯微鏡觀察。實驗結(jié)果判定參見表4。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，CLO溶血性試驗結(jié)果見表5。表4 紅細(xì)胞溶血、凝血判斷標(biāo)準(zhǔn)表5 CLO溶血性試驗結(jié)果
蒸餾水陽性對照管在15min觀察，溶液紅色透明，管底無紅細(xì)胞沉淀，鏡下無細(xì)胞，即為全部溶血。生理鹽水陰性對照管和1～5號CLO測試管各時段均為上部無色透明，紅細(xì)胞全部沉入管底，搖后紅細(xì)胞分散，液體呈紅色混濁。顯微鏡下觀察形態(tài)，數(shù)量正常，表示不溶血。
4 討論
4.1 CLO對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞形成微核的效應(yīng) 我們采用的小鼠微核試驗是20世紀(jì)70年代初建立的一種利用哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體改變來測定突變作用的實驗方法。具有檢測對骨髓細(xì)胞作用及染色體損傷效應(yīng)的方便、快捷、可靠的特點(diǎn)。已被國際組織如國際經(jīng)濟(jì)合作和發(fā)展組織(OECD)、國際誘變劑、致癌劑防護(hù)委員會(ICPEMC)等推薦為檢測致癌劑、誘變劑廣泛應(yīng)用的遺傳毒理學(xué)方法之一[7～9]。因此，我們利用微核試驗作為實驗手段是可行的。微核的形成，起因于染色體斷片或有絲分裂器紊亂，是由染色體斷片或整條染色體在細(xì)胞分裂后期，不能移到細(xì)胞紡錘體兩極而游離于細(xì)胞漿中而形成的。致斷裂物質(zhì)和紡錘體抑制劑都能導(dǎo)致微核的形成。CLO作為一種核苷酸類似物[8～10]，其經(jīng)脫氧胞苷激酶磷酸化為三磷酸鹽。首先能有效地抑制核苷酸還原酶，使DNA合成終止;同時也能抑制DNA聚合酶a ，使DNA鏈不再延長，形成染色體斷片。CLO對不同的細(xì)胞株和腫瘤模型都表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗癌活性，因此，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。有報道稱[1]，在2mg/m2的濃度劑量下，干細(xì)胞中CLO的代謝產(chǎn)物三磷酸鹽水平持續(xù)保持較高水平，此水平可持續(xù)抑制DNA的合成。目前，抗腫瘤藥物的特點(diǎn)是治療指數(shù)較小，選擇性較差。在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，對正常組織細(xì)胞特別是增殖更新較快的正常組織如骨髓、胃腸黏膜上皮、淋巴組織、毛囊和生殖細(xì)胞等產(chǎn)生不同程度的損害[10]。因此，在骨髓紅細(xì)胞的增殖過程中，可引起染色體有絲分裂紊亂而形成微核是必然的。我們的實驗結(jié)果，CLO與陽性對照組差異無顯著性(P>0.01)，而與陰性對照組差異有顯著性(P<0.05)，與有關(guān)報道[1]相一致。
4.2 CLO對雄性小鼠生殖細(xì)胞的影響 精子畸變試驗是判斷化合物是否具有生殖毒性的常用方法[3，5]，也是檢測致癌劑、誘變劑常用的遺傳毒理學(xué)方法，它是以精子的畸變率來評價化合物的生殖毒性和誘變性的。此試驗簡單、經(jīng)濟(jì)，可重復(fù)性強(qiáng)，實驗終點(diǎn)明確，結(jié)果陽性的化合物可認(rèn)為是哺乳動物生殖細(xì)胞的潛在誘變劑。在本研究中，精子畸變試驗的陽性對照環(huán)磷酰胺和陰性對照的生理鹽水兩組間比較，差異有顯著性(P<0.01)，證明本試驗系統(tǒng)具有可靠性[3，11，12]。研究結(jié)果表明，CLO測試組精子畸變率與陽性對照組差異無顯著性(P>0.05)，而與陰性對照組差異有顯著性(P<0.01)。因此，CLO對雄性昆明種小鼠有精子致畸作用，即可誘導(dǎo)遺傳突變。測試物誘變的作用機(jī)制在于誘發(fā)小鼠初級精母細(xì)胞染色體畸變，初級精母細(xì)胞染色體的變化，主要原因分析為細(xì)胞增殖周期中期的終變細(xì)胞DNA損傷而導(dǎo)致的[10]。
4.3 CLO對體外紅細(xì)胞的溶解性 對于一種新藥的處方工藝研究，溶血性亦是一個重要的篩選指標(biāo)。目前，國家食品藥品監(jiān)督管理局審評中心所發(fā)布的溶血試驗指導(dǎo)原則，是使用常規(guī)肉眼觀察法檢測制劑的溶血性。用該法檢測CLO的溶血性時，各時段均未有溶血現(xiàn)象，表明CLO的滲透壓及pH值與人紅細(xì)胞相一致，對紅細(xì)胞膜有很好的保護(hù)作用。據(jù)報道[1]，CLO對不同的細(xì)胞株和腫瘤模型都表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗癌活性。研究表明，本品的濃度水平在微摩爾以下就能有效地抑制人體CNS腫瘤，如肺癌、腎癌、白血病細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞等的增殖。在一定劑量下[4mg/(m2·d)],也會導(dǎo)致明顯的骨髓抑制。這與我們的研究中涉及的微核試驗和精子畸變試驗是相一致的。以往的生物試驗和醫(yī)學(xué)試驗表明[11～13]，小鼠得出的研究結(jié)果一般也適用于人類。所以，可以推斷，CLO在抑制腫瘤細(xì)胞的同時，對人類的染色體及精子細(xì)胞有一定的誘變作用。這需引起人們的高度重視，有必要從多種角度對其進(jìn)行安全性評估。建議長期用藥時一定要注意用藥劑量，安全用藥。
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