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梗阻性黃疸膽汁中膽管脫落細胞研究
畢業(yè)論文作者：蔡磊 曲強 何小東 周立 張晉夏
【摘要】 目的 建立梗阻性黃疸患者膽管引流膽汁中脫落細胞收集方法，比較膽管良性病變及惡性腫瘤膽管脫落細胞特征。方法 從臨床收集64例梗阻性黃疸患者引流膽汁，分離提取有核細胞，比較膽管結(jié)石和膽管癌病例膽管脫落細胞數(shù)量。涂片或應用瑞?姬雙染法染色后觀察不同病例膽管脫落細胞形態(tài)。結(jié)果 梗阻性黃疸膽汁引流中可收集到大量膽管脫落細胞。膽管癌病例膽管脫落細胞數(shù)量顯著多于膽管結(jié)石病例，分別為(4.70±0.82)×103個/ml和(3.80±0.98)×102個/ml(P<0.01)。膽管癌和膽管結(jié)石脫落細胞形態(tài)學觀察均具有明顯特征。結(jié)論 梗阻性黃疸膽管引流膽汁中存在較大量具有形態(tài)學特征的脫落細胞。這些細胞可以作為臨床鑒別診斷的重要依據(jù)，也是在細胞和分子水平探討膽管癌發(fā)生機制的可靠途徑。
【關鍵詞】 膽管脫落細胞； 膽管癌； 膽管結(jié)石； 梗阻性黃疸
【Abstract】 Objective To set up a method for collecting biliary cells in the bile drainage in patients with obstructive jaundice and compare the characteristics of cells between benign and malignant biliary cancer. Methods The bile drainages from 64 patients with obstructive jaundice were collected for extracting the biliary cells. Then, the cell number in the bile drainages from cholangiolithiasis was compared with that in the bile drainage from cholangiocarcinoma. The cell morphology was observed by cell smear or Wright?Giemsa′s staining. Results A considerable number of biliary cells were collected from the bile drainage. The cells in the bile drainage of patients with cholangiocarcinoma were (4.70±0.82)×103/ml, which was significantly more than (3.80±0.98)×102/ml in the bile drainage of those with cholangiolithiasis (P<0.01). The morphology of cells from cholangiocarcinoma or from cholangiolithiasis was distinguishable. Conclusions There exist large number of cast?off cells with morphological characteristics in the bile drainage of obstructive jaundice. They can be used as important basis for clinical differential diagnosis and as a reliable pathway of understanding mechanism of cholangiocarcinogenesis at cellular and molecular levels.
【Key words】 Biliary cells; Cholangiocarcinoma; Cholangiolithiasis; Obstructive jaundice
梗阻性黃疸在外科臨床上常見。膽管結(jié)石和膽管癌是導致梗阻性黃疸的主要病因。經(jīng)膽汁引流進行膽管脫落細胞的細胞學檢查，是近年來逐漸開展的診斷技術。多種非手術獲取細胞方法已被應用，如經(jīng)PTCD、ERCP引流膽汁或同時采用細胞刷取、組織鉗夾等技術［1］。但是，受膽汁引流量較少或操作技術限制，目前對病理狀態(tài)下膽管脫落細胞數(shù)量和形態(tài)缺乏整體認識， 細胞學診斷鑒別良惡性病變敏感性和穩(wěn)定性較差。本研究在改進膽汁收集方法基礎上， 比較膽管結(jié)石和膽管癌膽汁中脫落細胞特征，為進1步認識膽管病變過程中膽管上皮細胞形態(tài)，在細胞和分子生物學水平研究膽管惡性腫瘤發(fā)生提供新思路。
1 材料與方法
1.1 1般資料
我院基本外科2006年10月至2007年6月收治梗阻性黃疸患者64例，男34例，女30例；中位年齡56歲(29～82歲)。TB為63～468 μmol/L(正常范圍5.1～22.2 μmol/L)。所有患者在手術前均行PTCD治療，其中臨床診斷為膽管下段癌晚期2例和膽管中段癌3例分別放置膽管支架姑息治療，其余患者在TB降到15 μmol/L以下后進行手術治療。術后病理惡性病變31例(肝內(nèi)膽管癌4例，肝門部膽管癌7例，中段膽管癌13例，下段膽管癌7例。其中肝內(nèi)膽管中分化腺癌1例，肝內(nèi)膽管低分化腺癌3例，肝門部中分化膽管癌2例，肝門部低分化膽管癌4例，肝門部未分化膽管癌1例，膽總管高?中分化腺癌3例、膽總管中?低分化腺癌7例、膽總管低分化腺癌8例，壺腹腺癌2例)，良性病變33例(肝內(nèi)結(jié)石合并膽總管結(jié)石10例，膽總管結(jié)石22例，膽總管損傷后狹窄1例)。
1.2 膽管脫落細胞的收集
收集梗阻性黃疸患者膽道引流6 h內(nèi)的膽汁約200 ml，分別移至50 ml離心管(購自Corning公司)中，以1000 r/min離心20 min，棄上清后用40 ml PBS重懸，重復清洗膽汁4～5次。以Ficoll細胞分離液(購自Amersham公司)離心分離有核細胞，重懸后以細胞計數(shù)器計數(shù)細胞。
1.3 膽管脫落細胞的染色和觀察
重懸細胞至1 ml PBS平衡液中，移至加有載玻片和濾紙的細胞沉淀儀內(nèi)，4 ℃冰箱過夜，自然干燥，用4 ℃丙酮固定細胞10 min。瑞?姬雙染法進行染色：細胞固定好后加入瑞?姬雙染料混合物A液(Baso公司)3滴，染色3 min，再加染料緩沖液B液6滴，充分混勻后，染色3 min，自來水沖洗玻片1 min，干燥后封片。涂片及染色后細胞在Nikon Eclips 80顯微鏡下觀察，經(jīng)Nikon CCD(DS?5M?U1)采集系統(tǒng)收集記錄。
1.4 統(tǒng)計學分析
膽管癌和膽管結(jié)石膽汁中脫落細胞離心后分別計數(shù)，兩組細胞數(shù)以±s表示，組間均數(shù)比較采用ANOVA方法(SPSS 11.0軟件處理)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結(jié)果
良性或惡性膽管疾病所造成的梗阻性黃疸，膽道引流后每日收集膽汁引流量大致相同。觀察膽汁形狀發(fā)現(xiàn)膽管癌患者膽汁較稀薄，離心后涂片在光學顯微鏡下可見膽汁中脫落細胞數(shù)量多，呈聚集巢狀，形態(tài)不規(guī)則(圖1A)。膽管結(jié)石患者膽汁多較黏稠，雖經(jīng)反復清洗，涂片中仍有較多沉渣；鏡下觀察可見膽汁中脫落細胞形態(tài)規(guī)整均1，呈離散狀(圖1B)。細胞學檢查結(jié)果與手術中切除標本病理診斷符合率為100%。在同等量膽汁中，膽管癌膽汁中脫落細胞計數(shù)明顯多于膽管結(jié)石膽汁中脫落細胞，分別為(4.70±0.82)×103個/ml和(3.80±0.98)×102個/ml，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
瑞?姬雙染法染色顯示膽管癌膽汁中脫落細胞呈嗜堿性，體積大，成團聚集，視野中可見大量異形細胞。核質(zhì)比失調(diào)，細胞核呈濃染，核質(zhì)染色不均伴有核內(nèi)空泡形成，核仁肥大且數(shù)量多少不等，核膜增厚明顯，具有癌細胞特征(圖1C)。膽管結(jié)石膽汁中脫落細胞體積較小，染色呈嗜酸性，核質(zhì)比正常，細胞核著色均1，未見異常分裂象，與膽管癌的脫落細胞形態(tài)結(jié)構明顯不同(圖1D)。
3 討論
膽管癌是起源于膽管上皮的惡性腫瘤，確診時多為晚期，手術切除率低，預后差。目前膽管癌的病因尚未明確，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的膽管癌致病危險因素包括原發(fā)性硬化性膽管炎、肝血吸蟲病、先天性膽管囊腫、肝內(nèi)膽管結(jié)石、膽管損傷和丙型肝炎等。 Yeh等［2］發(fā)現(xiàn)膽管腔內(nèi)膽管癌的形成可能經(jīng)歷下列階段，即肝內(nèi)膽管結(jié)石、膽管上皮細胞不典型增生和原位或微小浸潤癌。因此，膽管結(jié)石或慢性炎癥所導致的膽管上皮不典型增生可能是膽管癌的癌前病變。但是，由于膽管在體內(nèi)的解剖位置特殊，目前研究多取自手術切除標本。如能在術前獲取膽管上皮細胞，不但有助于膽管疾病的診斷和鑒別，更對膽管惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的動態(tài)檢測，以及在細胞和分子生物學水平上深入認識膽管癌病因具有重要意義。
膽管脫落細胞檢查是臨床膽管梗阻病因診斷和鑒別診斷的重要方法，膽汁可經(jīng)PTCD、ERCP和T管引流等途徑取得。但是，以往應用此方法進行細胞學定性檢查時，發(fā)現(xiàn)膽管癌診斷敏感性低，僅為9.7%［3］。采用細胞刷直接刷取膽道的病變處，可獲得較多有代表性的細胞，提高診斷敏感性。文獻報道其敏感性為68%［4］，但仍存在相當高的假陰性。國內(nèi)報道認為造成上述細胞學敏感性或穩(wěn)定性較低的原因主要是病變膽道局部因素，如膽道腫瘤被纖維組織增生包埋而脫落不足、腫瘤細胞分化較好不易被辨認等。我們認為標本采集量不足也是結(jié)果不穩(wěn)定的重要原因。以往膽汁采集量多為3～5 ml，最多者20～50 ml，其中膽管脫落細胞數(shù)量不均1。我們首先擴大膽汁采集量，并在改進采集方法后發(fā)現(xiàn)，膽管癌膽汁中存在大量的腫瘤脫落細胞，每100 ml中細胞數(shù)可達105個，而且細胞無壞死，鏡下視野中絕大部分細胞形態(tài)符合腫瘤細胞特征。良性病變膽管結(jié)石的引流膽汁中亦有較多脫落上皮細胞。這些細胞形態(tài)均1，染色具有1般上皮細胞特點，鏡下較少找到異形性細胞。細胞學觀察與切除組織病理結(jié)果完全符合。腫瘤患者膽汁中脫落細胞數(shù)量普遍大于膽管結(jié)石患者引流膽汁中脫落細胞(P<0.01)，符合腫瘤細胞黏附力差、易脫落特征，也進1步說明樣本采集方法的可靠性。本研究結(jié)果說明，無論良性或惡性病變，膽管梗阻后引流膽汁中均存在較大數(shù)量脫落細胞，其形態(tài)特征具有病變代表性，可以作為臨床診斷依據(jù)和細胞及分子生物學研究的可靠樣本。由于部分膽管癌病例已無手術切除指征，膽管脫落細胞檢測成為診斷的惟1直接證據(jù)。此部分病例的病理學診斷和臨床進程均與我們細胞學檢測相符。與以往研究不同，我們每例樣本均為新鮮膽汁，采集量>200 ml，因此克服了以往由于樣本量少造成的敏感性和穩(wěn)定性差的缺點。
近年來的蛋白和基因表達研究顯示，部分生理情況下不表達或極少表達于膽管上皮的基因和相應蛋白，如黏蛋白、3葉肽和同源異型框蛋白等，在結(jié)石、膽管異形性上皮細胞乃至膽管癌時有異常表達［5-8］。這提示膽管結(jié)石及膽管上皮長期炎癥具有癌變傾向或在1定程度上需與癌前病變相鑒別。本研究建立的有效收集膽管脫落細胞的方法，1方面可以成為膽管癌早期診斷的依據(jù)，同時也是在細胞和分子生物學水平探討膽管癌發(fā)生機制的途徑。
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