談富集光合細(xì)菌培養(yǎng)基的優(yōu)化研究

時間：2023-03-17 22:55:22 其他畢業(yè)論文我要投稿

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　　論文關(guān)鍵詞:光合細(xì)菌　培養(yǎng)基　正交實(shí)驗

　　論文摘要:采用正交實(shí)驗設(shè)計,對一種富集光合細(xì)菌的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,試驗結(jié)果表明:酵母膏和NaHCO3在培養(yǎng)基中的濃度對富集紅螺菌科的光合細(xì)菌有顯著的影響。若以達(dá)到相同生長量(OD660值)做指標(biāo),應(yīng)用優(yōu)選出來的培養(yǎng)基進(jìn)行富集比原培養(yǎng)基要提前5~6 d。

　　光合細(xì)菌(PSB)是一大類能進(jìn)行光合作用的原核生物的總稱。研究應(yīng)用的實(shí)踐表明,光合細(xì)菌中的紅螺菌科能利用多種硫化物和有機(jī)物作為其光合作用的供氫體和有機(jī)碳源,在高濃度的有機(jī)廢水處理與資源化、水產(chǎn)養(yǎng)殖的水質(zhì)調(diào)控與促進(jìn)健康生長、在中作為高效活性菌肥等方面,發(fā)揮著十分有益的和令人矚目的作用[1]。光合細(xì)菌的推廣和應(yīng)用,需要合適的培養(yǎng)基質(zhì),但目前經(jīng)典的用于富集紅螺菌科光合細(xì)菌的培養(yǎng)基(小林達(dá)治1977)[2]平均富集的時間為2~8周,且存在培養(yǎng)基成分種類多,較高的缺點(diǎn)。為此,筆者在教學(xué)實(shí)踐中,對其進(jìn)行應(yīng)用型優(yōu)化設(shè)計,旨在為高活性光合細(xì)菌的推廣應(yīng)用提供一定的幫助。

　　1　和方法

　　1.1　樣品和菌種來源

　　光合細(xì)菌樣品來自湛江港岸潮間帶表層沉積物、湛江湖光巖附近奶牛養(yǎng)殖場和鴨塘的污水和底泥中。共分離出3種紅螺菌科菌株:沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、莢膜紅假單胞菌(Rhodopseudomonas capsulata)、紅螺菌(Rhodospirillumsp.),沼澤紅假單胞菌為優(yōu)勢菌群,故選沼澤紅假單胞菌為本試驗菌種。

　　1.2　培養(yǎng)基

　　富集培養(yǎng)基采用《微生物學(xué)實(shí)驗教程》[2]中配方:氯化銨0.1 g,碳酸氫鈉0.1 g(5%水溶液,過濾除菌取2 ml加入),磷酸氫二鉀0.02 g,乙酸鈉0.1~0.5 g(取0.3 g),七水硫酸鎂0.02 g,氯化鈉0.05~0.2 g,(取0.2 g)生長因子1ml,微量元素溶液1ml,蒸餾水97 ml,pH 7.0。

　　1.3　方法

　　1.3.1　富集培養(yǎng)基的初步優(yōu)選

　　1.3.1.1　NaHCO3利用試驗　在試驗過程中發(fā)現(xiàn):適當(dāng)?shù)奶岣逳aHCO3濃度,可縮短富集的時間。為探索其中量的關(guān)系,筆者做如下試驗設(shè)計:取滅菌的富集培養(yǎng)基以250 ml/瓶裝入醫(yī)用點(diǎn)滴瓶中,上鋪一層無菌液體石蠟, NaHCO3過濾除菌后依比例0.1%,0.15%,0.2%,0.25%,0.3%加入。每種培養(yǎng)條件做2個重復(fù)。沼澤紅假單胞菌(7.4×108個/ml)接種量為2%, 30℃,3000 lx光照強(qiáng)度下連續(xù)培養(yǎng)6d,每天在660 nm處測定其光密度OD值,以不加碳酸氫鈉的培養(yǎng)基接種做對照。

　　1.3.1.2　酵母膏對光合細(xì)菌生長的影響　紅螺菌科光合細(xì)菌生長需要硫胺素、生物素等生長因子。為此,在培養(yǎng)基中添加一定量的酵母膏能促進(jìn)光合細(xì)菌生長。將富集培養(yǎng)基中的生長因子和微量元素溶液分別用蒸餾水替代,酵母膏分別以0.01%,0.05%,0.1%,0.15%,0.2%,0.25%添加。同1.3.1.1接種培養(yǎng)3 d后,測定其OD660值。

　　1.3.2　改良培養(yǎng)基組成成分的正交試驗設(shè)計[3]為研究NaHCO3和酵母膏濃度對富集培養(yǎng)基的綜合效應(yīng)及和作為氮源的NH4Cl有無交互作用,采用L8(27)正交試驗設(shè)計(如表1),富集培養(yǎng)基100 ml,去除其中的生長因子和微量元素溶液

　　1.3.3　優(yōu)化培養(yǎng)基的確立分別從湛江港岸潮間帶表層、湛江湖光巖附近奶牛養(yǎng)殖場及鴨塘取淤泥、污水若干。50 g淤泥及100 ml污水裝入500 ml具塞磨砂廣口瓶,每個樣品4瓶。2瓶添加200 ml改良的富集培養(yǎng)基,另外2瓶添加原富集培養(yǎng)基。攪拌均勻后,加入滅菌的液體石蠟以隔絕空氣。25~35℃下用5000~10000 lx(距40 W白熾燈15~50 cm)的光照強(qiáng)度連續(xù)培養(yǎng)18 d,觀察記錄兩種富集培養(yǎng)基富集培養(yǎng)過程中光密度(OD660)變化。

　　2　結(jié)果與分析

　　2.1　富集培養(yǎng)基的初步優(yōu)選結(jié)果

　　2.1.1　NaHCO3利用試驗　

　　隨著NaHCO3濃度的增加,菌株到達(dá)穩(wěn)定生長期的時間縮短。NaHCO3濃度<2%時,菌體生長濃度隨NaHCO3濃度增加而增大。2%時,光密度值最大。說明此時光合細(xì)菌的生長條件最為適合(見圖1)。

　　2.1.2　酵母膏利用試驗　

　　隨著酵母膏濃度的增加,光合細(xì)菌菌體生長濃度逐漸增大。當(dāng)培養(yǎng)基中酵母膏的濃度為0.1%時,其菌體生長濃度和添加0.15%酵母膏時的生長濃度無顯著性差異,從角度考慮,選擇0.1%酵母膏較好(見圖2)。

　　2.2 正交實(shí)驗結(jié)果

　　從方差分析表結(jié)果可以看出:A因素(NaHCO3)和C因素(酵母膏)的主效應(yīng)是主要影響因素。酵母膏的含量對富集試驗結(jié)果的影響要更大一些。NaHCO3作為添加的碳源,和作為氮源的酵母膏、NH4Cl之間的交互作用都很小。培養(yǎng)基合適的C/N是微生物進(jìn)行正常生長繁殖的前提,從極差分析很容易選出最優(yōu)水平是A2B1C2,即改良培養(yǎng)基的NaHCO3含量為2.0 g,酵母膏含量為1.0 g,其他條件不變。從以上分析得出優(yōu)選培養(yǎng)基:氯化銨0.1 g,碳酸氫鈉0.2 g(5%水溶液,過濾除菌取4 ml加入),磷酸氫二鉀0.02 g,乙酸鈉0.1~0.5g(取0.3 g),七水硫酸鎂0.02 g,氯化鈉0.05~0.2 g(取0.2 g),酵母膏0.1 g,蒸餾水96 ml,pH 7.0。

　　2.3 優(yōu)化培養(yǎng)基的驗證結(jié)果

　　兩種富集培養(yǎng)基富集培養(yǎng)結(jié)果見圖3~圖5。由圖可見:海灘污水樣品中光合細(xì)菌使用改良富集培養(yǎng)基12 d培養(yǎng)液轉(zhuǎn)紅色(OD660=0.321),而原富集培養(yǎng)基富集培養(yǎng)液轉(zhuǎn)紅色(OD660=0.329)在第18 d出現(xiàn);鴨塘污水中光合細(xì)菌使用改良培養(yǎng)基富集11 d培養(yǎng)液轉(zhuǎn)紅色(OD660=0.326),而原富集培養(yǎng)基富集培養(yǎng)液轉(zhuǎn)紅色(OD660=0.329)則在第16 d出現(xiàn);奶牛場污水中光合細(xì)菌使用改良培養(yǎng)基富集11d培養(yǎng)液轉(zhuǎn)紅色(OD660=0.339),而原富集培養(yǎng)基培養(yǎng)液轉(zhuǎn)紅色(OD660=0.339)則在第16 d出現(xiàn)。使用改良培養(yǎng)基從3個地點(diǎn)(海灘、奶牛場、鴨塘)樣品中富集光合細(xì)菌比原培養(yǎng)基提前5~6 d。

　　3　討論

　　NaHCO3在富集光合細(xì)菌過程中有很大的作用。①用于調(diào)整培養(yǎng)液的pH。對于異養(yǎng)型光合細(xì)菌,一般使用5%的NaHCO3把pH調(diào)節(jié)到7.0~8.0。②NaHCO3產(chǎn)生的CO2在細(xì)菌營養(yǎng)代謝中具有重要作用。首先,CO2能與有機(jī)酸結(jié)合,生成多羧基酸,在三羧酸循環(huán)中起重要作用[4]。其次,CO2能促進(jìn)莢膜細(xì)菌莢膜的形成,推測其可促進(jìn)莢膜紅假單胞菌的增殖[5]。③富集培養(yǎng)相對于分離培養(yǎng)所用的時間較長,加大作為碳源的碳酸氫鈉的用量能延續(xù)增長光合細(xì)菌的數(shù)量,這點(diǎn)對于第一次富集培養(yǎng)尤為重要;但是NaHCO3不能加得過多,這是因為NaHCO3會導(dǎo)致培養(yǎng)液堿化而不利于光合細(xì)菌的生長;NaHCO3是富集螺旋藻等其他藻類的主要營養(yǎng)成分。加量過多,促進(jìn)藻類繁殖,光合細(xì)菌富集會受到影響。

　　酵母膏對光合細(xì)菌的生長有明顯的刺激作用。這主要是由于酵母膏的營養(yǎng)豐富,含有光合細(xì)菌所需要的各種生長因子。酵母膏濃度在0.25%以內(nèi)對菌體繁殖速度有很大的影響,但濃度過高,容易染菌,不利于分離[6]。

　　光合細(xì)菌是國內(nèi)外致力于開發(fā)的微生物資源,在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中具有去除NH4+和NO2-,改善水質(zhì),提高魚飼料營養(yǎng),促進(jìn)魚、蝦生長發(fā)育的功效。光合細(xì)菌的推廣應(yīng)用需要合適的培養(yǎng)基質(zhì),本試驗根據(jù)細(xì)菌的生長速度和產(chǎn)量來看,改良培養(yǎng)基效果良好。但能否是最佳方案,還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

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[3]　杜榮騫.生物學(xué)[M].北京:高等出版社,1985.476.

[4]　陳天壽.微生物的培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用[M].北京:中國出版社,1995.21.

[5]　http://content.edu.tw/junior/bio/tc_wc/textbook

[6]　郭慶文,吉海平.紫色非硫光合細(xì)菌的研究[J].飼料工業(yè),1994 ,15 (3):36-39.

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