大鼠饑餓中依賴嗅覺的探索行為及神經(jīng)機(jī)制
攝食行為是動(dòng)物最基本也最重要的行為方式，嚙齒類動(dòng)物通過嗅覺系統(tǒng)，完成食物的搜索，嗅覺系統(tǒng)對(duì)嚙齒類動(dòng)物的生存至關(guān)重要，下面是小編搜集整理的一篇探究饑餓嗅覺探索行為神經(jīng)機(jī)制的論文范文，歡迎閱讀查看。
饑餓可以定義為驅(qū)動(dòng)個(gè)體尋找和消化食物的感覺或動(dòng)力[1].攝食及覓食行為是動(dòng)物的最基本行為，以嗅覺系統(tǒng)為導(dǎo)向是嚙齒類動(dòng)物覓食的重要特點(diǎn)，嗅覺系統(tǒng)的基本構(gòu)成包括位于嗅粘膜上的感覺神經(jīng)元，大腦前端的嗅球，以及嗅皮層，嗅皮層中最關(guān)鍵部分為梨狀皮層[2].感覺神經(jīng)元及嗅球最主要的功能是對(duì)不同的氣味分子進(jìn)行識(shí)別，并形成精確的空間定位[3].嗅皮層主要完成對(duì)嗅覺信號(hào)的整合，形成嗅覺記憶，并把特定嗅覺信號(hào)和其他諸如顏色、味道、形狀、空間位置等感覺信息進(jìn)行整合[4].
動(dòng)機(jī)的形成有先天遺傳，也有后天的經(jīng)驗(yàn)和學(xué)習(xí)，但均依賴于腦內(nèi)特定的神經(jīng)環(huán)路及遞質(zhì)系統(tǒng)[5].動(dòng)物的覓食動(dòng)機(jī)和其饑餓狀態(tài)密切相關(guān)，饑餓狀態(tài)下動(dòng)物的覓食動(dòng)機(jī)增強(qiáng)，反應(yīng)在嗅覺系統(tǒng)對(duì)食物發(fā)出的氣味分子更加敏感，探索行為更加強(qiáng)烈[6].但對(duì)于饑餓狀態(tài)下，動(dòng)物覓食行為的反應(yīng)和梨狀皮層的關(guān)系尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)以大鼠為研究對(duì)象，利用食物埋藏，觀察大鼠饑餓狀態(tài)下依賴嗅覺的探索行為的變化，在此基礎(chǔ)上，利用熒光金標(biāo)記技術(shù)觀察嗅球到梨狀皮層的投射變化，利用c-fos標(biāo)記技術(shù)研究梨狀皮層神經(jīng)元活化水平。
一、材料和方法
1材料
雄性SD大鼠16只，體重250~300g,由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2006年科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。腦立體定位儀(成都泰盟公司，DW-2000腦立體定位儀)、冰凍切片機(jī)(Ther-mo,CryotomeE)、抗c-fos一抗(Sigma,A40215,1∶500)、熒光顯微鏡(Olympus,DP22)、偶聯(lián)cy3二抗(Bioss,bs-0296a-cy3).
2方法
2.1動(dòng)物和分組雄性SD大鼠16只，安靜環(huán)境飼養(yǎng)，12小時(shí)光照周期，溫度22~25℃，濕度65~75%之間，自由攝食飲水。16只大鼠隨機(jī)分成2組：禁食組(fastinggroup),正常組(controlgroup),每組8只，禁食組大鼠禁食48h,正常對(duì)照組給予正常飲食。
2.2嗅球置管大鼠用7%的水合氯醛(40mg/kg)腹腔麻醉，俯臥位，固定在立體定位儀上，頭部正中切口，剝離骨膜，使前后囟位于同一水平面。參照大鼠腦圖譜，將長(zhǎng)4.1cm、內(nèi)徑0.3mm、外徑0.4mm的不銹鋼帶內(nèi)芯套管植入大鼠左側(cè)嗅球(anteri-ortobregmaat7.7mm;laterialfrommidlineat1.6mm;deepfromskuat5mm),牙科水泥結(jié)合螺釘固定套管，旋緊套管帽，術(shù)后1周，創(chuàng)傷完全恢復(fù)，開始實(shí)驗(yàn)。
2.3清醒狀態(tài)下的熒光金注射禁食組連續(xù)禁食48h后，大鼠頭部固定，利用微量注射泵經(jīng)套管注射10%的熒光黃2μl,注射結(jié)束，旋緊套管帽。立即置于大鼠食物埋藏箱，并記錄大鼠找到全部食物的總時(shí)間。
2.4埋藏食粒法評(píng)價(jià)大鼠的嗅覺探索行為食物埋藏箱用正方形透明塑料盒制成(45cm×20cm×20cm),底部鋪5cm厚度的顆粒墊料，墊料經(jīng)消毒處理，和前期所用墊料相同。食物顆粒埋藏在大約1cm深處，位置如Fig.1A所示：共放置4枚食物，記錄找到4枚食粒的總時(shí)間。嗅覺探索行為結(jié)束后6h,立即處死動(dòng)物。
2.5全腦固定與切片嗅覺探索結(jié)束后6h,全部大鼠用7%的水合氯醛(40mg/kg)腹腔麻醉，打開胸腔，用250ml生理鹽水經(jīng)左心室快速灌注沖洗，再用4%多聚甲醛(PB配制，pH7.4)250ml灌注固定，立即開顱取腦，置人固定液4℃下過夜，再轉(zhuǎn)入20%蔗糖溶液(PB配制，pH7.4)4℃下放置，待沉底后，再移入30%蔗糖溶液(PB配，pH7.4)4℃下放置，待沉底后，連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚30μm,放置于冷凍保護(hù)液內(nèi)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.6c-fos免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)分析梨狀皮層神經(jīng)元活化水平根據(jù)大鼠腦圖譜，界定梨狀皮層位置，如Fig.1B所示。選取6張梨狀皮層平面，分別位于Bregma1.92mm,1.56mm,1.2mm,0.84mm,0.48mm,和0.12mm,相鄰切片之間距離為360μm.利用漂片法進(jìn)行c-fos的免疫熒光染色，根據(jù)常規(guī)免疫熒光方法，抗c-fos一抗(Sigma,1∶500),4℃,孵育24h,漂洗，偶聯(lián)cy3的二抗，室溫下避光孵育1h,漂洗，貼片，甘油封片，熒光顯微鏡觀察。
2.7熒光顯微鏡觀察FG及C-fos陽性神經(jīng)元在梨狀皮層的分布完成c-fos免疫熒光染色的腦片置于熒光顯微鏡下，首先用530nm的激發(fā)光顯示cy3,在左側(cè)梨狀皮層拍照，位置不變，轉(zhuǎn)換到紫外光，顯示FG,并拍照。每張腦切片在左側(cè)梨狀皮層，20倍物鏡下拍兩個(gè)視野。
2.8細(xì)胞計(jì)數(shù)方法采用盲法計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野下c-fos陽性細(xì)胞，F(xiàn)G陽性細(xì)胞，以及c-fos和FG雙陽性細(xì)胞。每只動(dòng)物計(jì)數(shù)6張腦片，12個(gè)視野，最后用每個(gè)視野的均值代表陽性細(xì)胞的數(shù)量。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：全部數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x珋±s)表示，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。數(shù)據(jù)處理用SPSS17.0version的統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，P<0.05表示差異具有顯著性。
二、結(jié)果
1饑餓對(duì)嗅探索行為的促進(jìn)作用
利用食物埋藏箱檢測(cè)饑餓對(duì)大鼠嗅覺探索行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，饑餓組大鼠找到全部8個(gè)食粒的時(shí)間明顯短于非饑餓組，結(jié)果見Fig.2.這說明饑餓促進(jìn)了覓食動(dòng)機(jī)，同時(shí)也有嗅覺敏化作用，能夠很快對(duì)食物的嗅覺信號(hào)產(chǎn)生記憶。
2梨狀皮層FG標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量變化
為觀察饑餓誘導(dǎo)的嗅覺探索行為敏化對(duì)嗅球到梨狀皮層投射的逆向軸漿運(yùn)輸有何影響，我們采用嗅球注射FG,觀察嗅覺探索行為是否能夠促進(jìn)從嗅球到梨狀皮層的軸漿運(yùn)輸效能，F(xiàn)G注射后6h,處死動(dòng)物，觀察在此期間FG在梨狀皮層神經(jīng)細(xì)胞的聚集情況，間接反應(yīng)梨狀皮層神經(jīng)細(xì)胞的活動(dòng)狀態(tài)。結(jié)果可見，饑餓組梨狀皮層FG陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，和非饑餓組比較差異有顯著性。
3梨狀皮層C-fos標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量變化
c-fos可以標(biāo)記刺激活動(dòng)依賴性神經(jīng)元。饑餓對(duì)大鼠嗅覺探索具有促進(jìn)作用，這一促進(jìn)作用，僅僅是嗅球?qū)用�，還是涉及到高一級(jí)神經(jīng)元，我們利用c-fos免疫熒光技術(shù)，結(jié)合半定量，觀察梨狀皮層在嗅覺探索行為誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞活化方面有無差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，饑餓組梨狀皮層c-fos陽性神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量也增加了。
4梨狀皮層FG+/C-fos+雙標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的變化
為了進(jìn)一步觀察嗅刺激誘導(dǎo)的活化神經(jīng)元，是否也存在逆向軸漿運(yùn)輸?shù)脑黾樱覀兝肍G和c-fos雙標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合半定量觀察梨狀皮層FG/c-fos雙陽性細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，饑餓組雙陽性細(xì)胞的數(shù)量也明顯多于非饑餓組，兩組之間比較有差異性，結(jié)果見Fig.5.
三、討論
1梨狀皮層對(duì)嗅覺信號(hào)的整合
攝食行為是動(dòng)物最基本也最重要的行為方式，嚙齒類動(dòng)物通過嗅覺系統(tǒng)，完成食物的搜索，對(duì)特定食物通過食物的特定氣味形成記憶，區(qū)別有毒和無毒，因此嗅覺系統(tǒng)對(duì)嚙齒類動(dòng)物的生存至關(guān)重要，嚙齒類動(dòng)物因此也進(jìn)化出了發(fā)達(dá)的嗅覺系統(tǒng)，大鼠的嗅粘膜占鼻黏膜的比例，以及嗅腦占全腦的比例都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于人類，嗅粘膜感受氣味信號(hào)之后，特定的氣味分子通過激活一種或是幾種G蛋白偶聯(lián)受體，引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)cAMP依賴性的鈉離子通道開放，完成從化學(xué)信號(hào)向電信號(hào)的轉(zhuǎn)換，并進(jìn)而向上經(jīng)感覺神經(jīng)元的軸突，將此信息傳導(dǎo)至特定的.嗅小球，完成氣味信號(hào)的空間定位[7].而更為復(fù)雜的氣味信號(hào)分析和整合，則依賴于更高位的中樞結(jié)構(gòu)，如梨狀皮層，梨狀皮層對(duì)嗅覺信號(hào)的分析可能和特定嗅覺記憶有關(guān)，也可能參與了嗅覺的敏化和鈍化過程[8].
我們的研究表明，饑餓導(dǎo)致的嗅覺敏化和對(duì)特定食物的嗅覺記憶和梨狀皮層關(guān)系密切，在饑餓大鼠攝食行為過程，伴隨有從嗅球腦到梨狀皮層的投射增強(qiáng)，軸漿運(yùn)輸增加，F(xiàn)G陽性細(xì)胞在梨狀皮層數(shù)量明顯增加。
2嗅覺敏化對(duì)梨狀皮層的激活
在饑餓狀態(tài)下，動(dòng)物對(duì)食物的敏感度增加，包括對(duì)食物的嗅覺探索，這種嗅覺敏化，一方面可能涉及饑餓狀態(tài)下和食物氣味相關(guān)的受體分布會(huì)增加[9],另一方面從嗅球到高位皮層的神經(jīng)激活也會(huì)增加，我們的研究發(fā)現(xiàn)梨狀皮層神經(jīng)元表達(dá)c-fos的細(xì)胞數(shù)量增加，這表明饑餓狀態(tài)下以嗅覺為導(dǎo)向的覓食行為和梨狀皮層神經(jīng)元活化有密切的聯(lián)系。
3梨狀皮層可能參與嗅覺探索行為的動(dòng)機(jī)
形成行為的產(chǎn)生除行為執(zhí)行的器官之外，動(dòng)機(jī)是確保行為發(fā)放的關(guān)鍵，腦內(nèi)有和動(dòng)機(jī)相關(guān)的腦區(qū)，通過特定的神經(jīng)環(huán)路，決定行為是否發(fā)放，何時(shí)發(fā)放，其中前額皮層(PFC)在動(dòng)機(jī)形成中起關(guān)鍵作用，而梨狀皮層和PFC之間有往返投射，因此梨狀皮層可能參與了嗅覺主導(dǎo)的動(dòng)機(jī)形成[10,11].
在過去十余年時(shí)間內(nèi)，對(duì)氣味分子的識(shí)別機(jī)制，嗅粘膜到嗅球的投射規(guī)律，嗅小球?qū)μ囟ㄐ嵊X信號(hào)的空間定位都有了比較深入的了解，但高位皮層對(duì)嗅覺信號(hào)的整合、調(diào)制，如何完成嗅覺記憶及嗅覺的敏化和鈍化，依然有很多不清楚的地方。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在饑餓狀態(tài)下，嗅覺探索行為的敏化和效能提高有大量梨狀皮層神經(jīng)元的參與。
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