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轉(zhuǎn)氨酶在手性化合物合成中涉及項目的現(xiàn)狀綜述
蛋白工程是指通過改變已知蛋白的結(jié)構(gòu)來改變其性質(zhì)的過程，需要借助計算機(jī)和生物信息學(xué)手段來實現(xiàn)，是研究酶的功能及進(jìn)化的重要技術(shù)，下面是小編搜集整理的一篇探究轉(zhuǎn)氨酶在手性化合物合成現(xiàn)狀的論文范文，歡迎閱讀查看。
前言
近年來，手性制藥工業(yè)迅速發(fā)展壯大，單一對應(yīng)體藥物每年以大于20%的速度增長，其對手性胺的需求也隨之增長。目前，超過70%的藥物都是手性胺及其衍生物，如神經(jīng)類藥物、心血管藥物、抗高血壓藥物、抗感染藥物及疫苗等的合成都是以手性胺作為中間體，抗糖尿病新藥Janu-via的主要成分西他列汀是R-型胺。這就催促人們尋找一種高效制備手性胺的方法，而轉(zhuǎn)氨酶的出現(xiàn)使研究者看到了曙光。轉(zhuǎn)氨酶以其高選擇性、高轉(zhuǎn)化率及溫和的反應(yīng)條件贏得了廣大研究者的青睞，其能夠催化1個氨基供體(氨基酸或簡單的胺)上的氨基轉(zhuǎn)移到前手性的受體酮，得到手性胺和副產(chǎn)物酮或者α-酮酸(圖1)，反應(yīng)過程需要磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate，PLP)的參與。
轉(zhuǎn)氨酶合成手性化合物已經(jīng)發(fā)展為一項關(guān)鍵的不對稱合成技術(shù)，受到越來越受到眾多研究者的重視和關(guān)注。2013年2月28日，第一屆國際轉(zhuǎn)氨酶生物催化研討會于瑞典斯德哥爾摩召開，鑒于此，本文作者將轉(zhuǎn)氨酶在手性化合物合成中涉及到的蛋白工程、表達(dá)與固定化、進(jìn)程工程及應(yīng)用方面的研究現(xiàn)狀予以綜述。
1轉(zhuǎn)氨酶蛋白工程
蛋白工程是指通過改變已知蛋白的結(jié)構(gòu)來改變其性質(zhì)的過程，需要借助計算機(jī)和生物信息學(xué)手段來實現(xiàn)，是研究酶的功能及進(jìn)化的重要技術(shù)，也是改變酶性質(zhì)、開發(fā)新酶的重要方法。利用蛋白工程的方法對轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行改造即為轉(zhuǎn)氨酶蛋白工程，其目的是得到有工業(yè)應(yīng)用價值的酶，打通手性藥物及化工產(chǎn)品的酶法合成途徑。所用關(guān)鍵技術(shù)包括理性設(shè)計、定向進(jìn)化以及兩者組合方法;所涉及工具主要包括迭代飽和誘變(it-erativesaturationmutagenesis，ISM)、組合活性位點飽和測試(combinationofactivesitesaturationtest，CASTing)、蛋白序列活性關(guān)系(proteinse-quenceactivityrelationship，ProSAR)等。隨著計算機(jī)技術(shù)以及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)氨酶蛋白工程迎來了第三次浪潮，成為國內(nèi)外研究熱點。
轉(zhuǎn)氨酶蛋白工程主要包括5個步驟:選擇合適的模板、穩(wěn)定模板、確定活性位點、活性位點周圍氨基酸殘基理性設(shè)計或定向進(jìn)化、突變體活性評估。經(jīng)過以上幾步，就可以根據(jù)人們的意愿將一個原本對某一底物無活性的轉(zhuǎn)氨酶變?yōu)閷Υ说孜锘钚院芨叩纳锎呋瘎�，在此方面最成功的例子�?dāng)屬Savile等利用蛋白工程手段得到的突變型ATA-117，其能夠用于工業(yè)化生產(chǎn)西他列汀。到目前為止，此酶是轉(zhuǎn)氨酶工業(yè)化應(yīng)用最成功的例子，利用該酶的西他列汀生物催化合成工藝獲得2010年美國總統(tǒng)綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎。目前，國內(nèi)外很多課題組都在進(jìn)行轉(zhuǎn)氨酶蛋白工程的研究，近五年來，新型轉(zhuǎn)氨酶如雨后春筍般涌出(表1)。
2轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)與固定化
轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)目前有3種途徑。第一，利用原始菌株表達(dá)，由于原始菌株表達(dá)量低及效率低下等不足，此途徑現(xiàn)一般只在新產(chǎn)酶菌株初步篩選階段使用;第二，利用工程菌表達(dá)，此法應(yīng)用最多，目前轉(zhuǎn)氨酶已經(jīng)在原核與真核系統(tǒng)中實現(xiàn)表達(dá)。原核表達(dá)普遍采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，例如Iwasaki等成功構(gòu)建一種R-型轉(zhuǎn)氨酶(R-TA)的表達(dá)工程菌E.coliHB101-pAT28-R-TA，通過工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)可以得到大量R-TA;Savile等構(gòu)建工程菌E.coliW3110-pCK110700-ATA-117表達(dá)ATA-117及突變酶;Cassimjee等利用工程菌E.coliBL21(DE)-pET28-ATA-113成功實現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶ATA-113的大量表達(dá)。原核表達(dá)系統(tǒng)是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)，其優(yōu)點在于能夠在較短時間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，而所需的成本相對低廉。但原核表達(dá)系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點，如無法對表達(dá)時間及表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，目的蛋白易形成包涵體，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難。為彌補(bǔ)以上不足，許多學(xué)者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入真核基因調(diào)控領(lǐng)域，采用真核系統(tǒng)進(jìn)行目標(biāo)蛋白的表達(dá)。真核表達(dá)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞三種系統(tǒng)，目前，轉(zhuǎn)氨酶多采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，如Bea等成功構(gòu)建了ω-TA的真核表達(dá)系統(tǒng)P.pastorisGS115-pPIC-ω-TA;Weinhandl等通過轉(zhuǎn)氨酶基因密碼子優(yōu)化，構(gòu)建了能夠大量表達(dá)ilvE的P.pastorisMut-SpPpT4_S/pPpT4_GAP_S-ilvE。真核表達(dá)系統(tǒng)能誘導(dǎo)基因高效表達(dá)，可達(dá)原始表達(dá)量的105倍，另外，其還能嚴(yán)格調(diào)控基因表達(dá)，是原核表達(dá)系統(tǒng)所不能及的，因此，利用真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)目的蛋白越來越受到重視，其多用于可調(diào)控的轉(zhuǎn)氨酶的大量表達(dá)。第三，通過無細(xì)胞體系表達(dá)。Kwon等建立了一種無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)成功實現(xiàn)了ω-TA的非克隆性表達(dá)，此方法主要使用于轉(zhuǎn)氨酶的高通量篩選。
在轉(zhuǎn)化中作者通常用到2種酶形式:游離酶和固定化酶。游離酶活性雖高但是只能用1次，且會影響產(chǎn)物的分離純化，而固定化酶則會大大提高重復(fù)利用率，因此成為了研究重點。轉(zhuǎn)氨酶的固定化包括固定化細(xì)胞和固定化游離酶。固定化細(xì)胞所用材料主要是殼聚糖、海藻酸鈉以及一種新型材料LentiKats。Rehn等發(fā)現(xiàn)利用殼聚糖固定化含有ω-TA的大腸桿菌細(xì)胞，在優(yōu)化條件下，細(xì)胞加載量可達(dá)3.2g·g-1殼聚糖，殘留活性大于60%，在1h的反應(yīng)中，連續(xù)8次反應(yīng)，固定化酶活性仍大于90%。Fernandez等利用LentiKats固定化含有ω-TA的大腸桿菌細(xì)胞，其穩(wěn)定性得到了提高，在連續(xù)五次合成1-苯乙胺及3-氨基-丁苯后，殘留活性仍大于80%。固定化游離酶所用材料主要有聚合樹脂、溶膠/硅藻土基質(zhì)、殼聚糖、硅膠。Truppo等利用一種聚合樹脂SEPABEADEXE120成功固定化西他列汀轉(zhuǎn)氨酶(突變型ATA-117)，固定化酶以異丙醇為溶劑，在200g·L-1底物濃度下，重復(fù)使用10次，連續(xù)反應(yīng)200h，其活性并無損失。Mallin等利用優(yōu)化的殼聚糖固定化兩個R-TA，兩個固定化酶對于1-苯乙胺的合成都有很好的活性，其中一種轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化在合成R-2-己胺時，活性比游離酶提高了13.4倍，轉(zhuǎn)化率大于99%。此外，Matosevic等利用固定化酶微反應(yīng)器平臺成功實現(xiàn)了手性氨基醇多步生物轉(zhuǎn)化篩選過程。由以上例子可以看出，轉(zhuǎn)氨酶的固定化在提高酶穩(wěn)定性、拓寬酶使用范圍以及改善酶反應(yīng)條件方面都有重要意義，通過固定化，有望克服游離酶反應(yīng)的過程瓶頸，實現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶工業(yè)化應(yīng)用。但是固定化酶由于傳質(zhì)限制，酶活性會普遍降低，同時固定化酶的制備增加了酶的成本，因此更加優(yōu)越的固定化介質(zhì)有待開發(fā)。
3轉(zhuǎn)氨酶過程工程
轉(zhuǎn)氨酶催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)是一個熱力學(xué)平衡過程，主要包括兩個互補(bǔ)的反應(yīng):手性胺的不對稱合成和外消旋胺的運力學(xué)拆分。以上兩個反應(yīng)過程受反應(yīng)物、產(chǎn)物、反應(yīng)條件等因素影響，反應(yīng)時所發(fā)生的平衡逆向移動是轉(zhuǎn)氨反應(yīng)中的瓶頸問題。因此，要實現(xiàn)高效率不對稱合成就需要從影響因素入手，改變反應(yīng)的平衡。眾多學(xué)者就此問題進(jìn)行了深入的研究，現(xiàn)將解決方案歸納如下:
3.1加入過量的氨基供體
改變平衡的一個最簡單的方法就是加入過量的氨基供體，Savile等在生產(chǎn)西他列汀時就采用了此方法:在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，向40mL反應(yīng)體系中加入2-丙胺39.8mmol，前西他列汀酮18.9mmol，此時氨基供體的量是氨基受體的2倍;在放大的反應(yīng)體系中，加入高達(dá)10倍過量氨基供體，反應(yīng)得到西他列汀的轉(zhuǎn)化率為92%。
需要注意的是此種方法只適用于反應(yīng)的平衡對產(chǎn)物產(chǎn)率影響不大的情況。如果平衡嚴(yán)重不利于產(chǎn)物的生成，而反應(yīng)所需的底物質(zhì)量濃度比較高(>50g·L-1)，氨基供體和受體按照1～50∶1的摩爾比進(jìn)行反應(yīng)，氨基供體的過量倍數(shù)將會受到限制，加入太多的氨基供體將會出現(xiàn)可溶性差等其他的問題。
3.2副產(chǎn)物的自動降解
副產(chǎn)物自動降解是利用副產(chǎn)物在反應(yīng)條件下自動形成另外一種非反應(yīng)成分，達(dá)到解決抑制的目的。Lo等發(fā)現(xiàn)以鳥氨酸和賴氨酸作為氨基供體時，反應(yīng)產(chǎn)生的氨基酮會自動環(huán)化，使平衡向生成胺的方向移動。同樣Truppo等在利用轉(zhuǎn)氨酶合成6-甲基-2-吡咯酮(50g·L-1)的反應(yīng)中(圖2)，利用一級產(chǎn)物乙胺基丁酰乙酯的自動環(huán)化，形成非抑制性終產(chǎn)物6-甲基-2-吡咯酮的反應(yīng)趨勢，解除一級產(chǎn)物抑制，獲得終產(chǎn)物時轉(zhuǎn)化率大于90%，產(chǎn)物ee值大于99%。副產(chǎn)物自動降解是一種非常傳統(tǒng)的方法，受到副產(chǎn)物性質(zhì)限制，其應(yīng)用并不多。
3.3移除產(chǎn)物或副產(chǎn)物
由于產(chǎn)物或副產(chǎn)物的存在，常常會對平衡產(chǎn)生抑制作用，因此可以通過在反應(yīng)時移除產(chǎn)物或者副產(chǎn)物的方法來改變平衡，這種方法也稱為在位產(chǎn)物移除(insituproductremoval，ISPR)，ISPR的效率與產(chǎn)物胺以及其它反應(yīng)組分的性質(zhì)有關(guān)。
其中產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)如揮發(fā)性、溶解性、帶電性、疏水性、和分子大小是ISRP中研究最多的幾個方面。
實現(xiàn)ISPR的途徑有多種。Koszeiewski等在利用ATA-117轉(zhuǎn)化4-苯基-2-丁酮合成R-4-苯基丁-2-胺的過程中，綜合運用有機(jī)溶劑萃取和調(diào)整pH的方法使反應(yīng)物的轉(zhuǎn)化率達(dá)到92%，ee值高達(dá)99%;Truppo等在利用ATA-113和ATA-117轉(zhuǎn)化苯乙酮合成α-甲基苯乙胺的過程中采用樹脂提取技術(shù)成功獲得了高達(dá)99%的轉(zhuǎn)化率，與之前不采用ISPR技術(shù)的轉(zhuǎn)化率10%相比，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率得到了大幅度的提高。另外讓易揮發(fā)的副產(chǎn)物揮發(fā)掉也可以作為改變平衡的一個方法。
當(dāng)以2-丙胺或者2-丁胺作為氨基供體時，會產(chǎn)生副產(chǎn)物丙酮或者丁酮，由于丙酮和丁酮與其它反應(yīng)物相比具有較低的沸點，因此可以通過減壓使副產(chǎn)物揮發(fā)掉，這樣轉(zhuǎn)氨反應(yīng)就趨于完全。此外對于易揮發(fā)的胺還可以通過蒸餾的方法進(jìn)行產(chǎn)物回收，這種方法多用于動力學(xué)拆分。
3.4酶偶聯(lián)反應(yīng)
酶偶聯(lián)反應(yīng)是指將轉(zhuǎn)氨反應(yīng)與其它酶促反應(yīng)聯(lián)合使用，將副產(chǎn)物(丙酮酸或者丙酮)轉(zhuǎn)化為非反應(yīng)成分或者原始的底物。此方法是到目前為止研究和應(yīng)用最多的提高不對稱合成產(chǎn)率的途徑，表2對常用的酶級聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行了總結(jié)。Cassimjee等用來自A.citreus的具有S-選擇性的ω-轉(zhuǎn)氨酶作為催化劑，以異丙胺為氨基供體，在催化苯乙酮合成S-1-苯乙胺的反應(yīng)(圖3)中引入平衡置換系統(tǒng):YADH/FDH(yeastalcoholdehydrogenase/formatedehydrogenase)，其中YADH將生成的丙酮轉(zhuǎn)化為2-羥基丙醇，F(xiàn)DH再生輔因子NADH(nicotinamideadeninedinucleotideplushydro-gen)，驅(qū)動反應(yīng)正向進(jìn)行，成功獲得高達(dá)99%的產(chǎn)率和99.9%的ee(enantiomericexcessvalue)值，未引入平衡置換系統(tǒng)的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率只有60%～80%。Schatzle等利用七種R-型轉(zhuǎn)氨酶合成R-胺時，引入LDH/GDH(lactatedehydro-genase/glucosedehydrogenase)系統(tǒng)，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，使得產(chǎn)物產(chǎn)率高達(dá)99%。其中LDH將丙酮酸轉(zhuǎn)化為2-羥基丙酮酸，GDH用來再生輔因子NADH，轉(zhuǎn)氨酶聯(lián)合LDH/GDH達(dá)到了高效合成手性胺的目的，此外在以上兩個反應(yīng)體系中，由于使用輔因子再生系統(tǒng)，在一定程度上降低了反應(yīng)的經(jīng)濟(jì)成本。Truppo等在轉(zhuǎn)氨酶ATA-117拆分外消旋苯乙胺的反應(yīng)體系中加入D-氨基酸氧化酶，實現(xiàn)了丙酮酸再生，同時反應(yīng)的平衡也發(fā)生了移動，反應(yīng)1h，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到50%，(S)-1-苯乙胺ee值高于90%，而之前反應(yīng)1h轉(zhuǎn)化率只有7.5%，產(chǎn)物ee值只有8%。由此可見利用酶偶聯(lián)反應(yīng)可以大大提高不對稱合成以及動力學(xué)拆分的產(chǎn)率，對于小規(guī)模制備來說是一種高效可行的方法。
合理的酶反應(yīng)系統(tǒng)是獲得高轉(zhuǎn)化率的保證。酶的性質(zhì)、反應(yīng)體系中各成分的相互作用、輔因子的加入量等都會影響反應(yīng)效率，比如在FDH體系中加入高濃度的甲酸鹽會影響其它酶的活性和穩(wěn)定性。Santacoloma等對酶級聯(lián)反應(yīng)相關(guān)問題做了詳細(xì)的討論。酶級聯(lián)反應(yīng)的效率雖然很高但是其經(jīng)濟(jì)成本很高，不適合大規(guī)模制備。一個替代途徑就是用全細(xì)胞作為催化劑。利用生物技術(shù)的方法實現(xiàn)目標(biāo)酶在宿主菌中共表達(dá)，利用全細(xì)胞進(jìn)行催化。Yun等利用可以共表達(dá)ω-TA和乙酰乳酸合成酶的Ecoli全細(xì)胞作為催化劑，成功合成了S-α-甲基苯胺，Bea等利用含有ω-TA和內(nèi)源性氧化還原酶的重組畢赤酵母為催化劑，成功拆分α-苯乙胺，ee>99%，轉(zhuǎn)化率達(dá)52.2%。此外，Wang等開發(fā)了一種新的單酶級聯(lián)反應(yīng)體系，用ω-TA催化高效不對稱合成手性胺，克服了多酶級聯(lián)反應(yīng)的成本高、酶不兼容等缺點，但是此方法目前并不能用于手性胺的大量生產(chǎn)。
4轉(zhuǎn)氨酶應(yīng)用
轉(zhuǎn)氨酶主要用于手性胺、手性氨基酸、手性氨基醇等的合成，這些手性化合物在制藥工業(yè)、農(nóng)業(yè)、化工業(yè)都有重要的作用，其常作為藥品的活性成分或主要中間體被使用。目前，立體選擇性的合成以上手性化合物主要是通過化學(xué)法實現(xiàn)，如大家熟知的不對稱還原Stiff堿，但是化學(xué)法存在一些不足，如反應(yīng)條件苛刻、運用有毒的過渡態(tài)金屬催化劑等，有時候在單一的催化反應(yīng)中得不到足夠的立體選擇性，引起了一系列的環(huán)境問題，產(chǎn)品也不符合藥物要求。然而利用轉(zhuǎn)氨酶催化制備相應(yīng)的手性化合物反應(yīng)條件溫和、過程簡單、立體選擇性高，逐漸取代了一些化學(xué)步驟。利用酶法、化學(xué)-酶法合成含手性胺的活性藥物以及小分子手性胺非常具有發(fā)展前景。下面從四個方面介紹轉(zhuǎn)氨酶在合成手性化合物中的應(yīng)用。
4.1合成手性胺
手性胺是合成許多手性藥物的重要中間體，也是含氨基的光學(xué)純藥物的主要成分。神經(jīng)類藥物、心血管藥物、抗高血壓藥物、抗感染藥物及疫苗等都是以手性胺作為中間體;而抗糖尿病新藥Januvia的主要成分西他列汀是R-型丁二胺。
在手性胺的合成中兩者同樣重要。下面逐一介紹。
a.不對稱合成，是指在合適的氨基供體(如異丙胺，L-丙氨酸)存在下，轉(zhuǎn)氨酶催化前手性酮生成相應(yīng)的手性胺的過程。其又可細(xì)分為兩類，酶一步合成法和化學(xué)-酶合成法。例如，Savile等利用突變型R-轉(zhuǎn)氨酶ATA-117不對稱合成西他列汀，經(jīng)過一步反應(yīng)，成功得到西他列汀，實現(xiàn)了西他列汀200g·L-1的工業(yè)化生產(chǎn)，24h轉(zhuǎn)化率>95%，ee>99.5%(圖4);Fuchs等成功采用化學(xué)酶法全合成得到(S)-利斯的明，其首先利用ω轉(zhuǎn)氨酶合成所需的前體1-苯乙胺，并利用酶偶聯(lián)反應(yīng)解決平衡移動問題，后利用化學(xué)法合成其余基團(tuán)(圖5)，經(jīng)過四步反應(yīng)，整體收率達(dá)71%，ee>99%。以上例子的成功都是非常激動人心的，但由于反應(yīng)的可逆性，其轉(zhuǎn)化率理論不能達(dá)到100%，因此，解決平衡移動問題仍然是今后需要深入研究的。
b.動力學(xué)拆分，是指在合適的氨基受體(如苯乙酮)存在下，轉(zhuǎn)氨酶催化外消旋胺生成光學(xué)純手性胺的過程。其實質(zhì)也是轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，只是在本反應(yīng)中氨基供體為外消旋胺中一個構(gòu)型的胺，轉(zhuǎn)氨酶將一個構(gòu)型的氨基轉(zhuǎn)移至氨基受體上，得到與轉(zhuǎn)氨酶選擇性相反的光學(xué)純的胺。理論上，轉(zhuǎn)化率>50%所得產(chǎn)物的ee>99%，拆分效果較好。例如，Koszelewski等利用R和S-2種轉(zhuǎn)氨酶組成一鍋兩步法用于美西律的去消旋化，成功獲得了光學(xué)純的美西律，其收率達(dá)97%，ee>99%，這也是拆分和不對稱合成相結(jié)合比較成功的例子(圖6)。動力學(xué)拆分能夠成功得到高光學(xué)純的產(chǎn)物，同時引入了底物酮，若采用Koszelewski所述的方法將能成功變廢為寶，達(dá)到雙贏的目的。
c.工業(yè)應(yīng)用情況:一個生物催化劑要應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中，其底物質(zhì)量濃度至少應(yīng)達(dá)到50g·L-1，因此大部分轉(zhuǎn)氨酶，由于底物濃度、反應(yīng)溫度、有機(jī)溶劑耐受性等眾多因素的限制目前只停留在實驗室階段。近幾年轉(zhuǎn)氨酶在工業(yè)應(yīng)用最成功的例子當(dāng)屬突變型ATA-117，其能夠用于西他列汀的工業(yè)生產(chǎn)。除此外，其他小分子胺的生產(chǎn)也達(dá)到了工業(yè)要求，如Truppo等采用轉(zhuǎn)氨酶與LDH偶聯(lián)以及離子交換樹脂在位移除產(chǎn)物兩種方法，成功實現(xiàn)了R/S甲基苯乙胺以及R/S6-甲基-2-哌啶酮50g·L-1的高效生產(chǎn)，其收率>90，ee>99%。表3對近幾年利用轉(zhuǎn)氨酶生產(chǎn)手性胺的情況進(jìn)行了歸納總結(jié)，由此可見轉(zhuǎn)氨酶在制備手性胺方面具有較大的應(yīng)用潛力和開發(fā)價值，是目前及未來的研究熱點。
4.2合成手性氨基酸
光學(xué)純的氨基酸在生物體內(nèi)起著舉足輕重的作用，同時在制藥工業(yè)有著重要的作用。很多α-和β-氨基酸及其衍生物是生物體內(nèi)關(guān)鍵的神經(jīng)遞質(zhì)，如谷氨酸鹽、γ-氨基丁酸;而很多非蛋白氨基酸則在生物次級代謝過程中有重要作用，圖7對含氨基酸的藥物進(jìn)行了總結(jié)。2008年之前，開發(fā)有藥學(xué)活性的光學(xué)純氨基酸吸引了眾多藥學(xué)家的眼球，利用轉(zhuǎn)氨酶制備芳香族β-氨基酸、L-α-氨基酸，脂肪族L-α-氨基酸以及D-氨基酸、15N標(biāo)記的氨基酸等層出不窮，Hohne等對此進(jìn)行了綜述。
到目前為止，生物催化法制備手性氨基酸最成功的例子為L-高苯丙氨酸的制備。L-高苯丙氨酸是制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑藥物的重要原料，它是目前世界上約20種抗高血壓新藥的共同中間體，如依拉普利、地拉普利、西拉普利等。目前用于制備手性氨基酸的轉(zhuǎn)氨酶種類很多如酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、ω-轉(zhuǎn)氨酶等。Lo等用工程化的大腸桿菌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶高效制備了L-高苯丙氨酸。Min等用固定化的消旋酶及氨甲酰水解酶由相應(yīng)底物制備L-高苯丙氨酸，此固定化酶可重復(fù)利用14次，實現(xiàn)了轉(zhuǎn)氨酶的重復(fù)高效利用，更有利于工業(yè)化應(yīng)用。
4.3合成手性氨基醇
手性氨基醇結(jié)構(gòu)中含有手性氨和手性醇，是一類更有價值的生化試劑及藥物中間體，如抗病毒糖苷酶抑制劑、鞘脂類藥物，廣譜抗生素氯霉素、甲砜霉素等眾多藥物中均含有手性氨基醇。目前生產(chǎn)手性氨基醇的方法有化學(xué)法和生物催化法2種，相對于化學(xué)法，生物催化法更加綠色、高效，因此便成為研究熱點。
生物催化法制備手性氨基醇主要由有3種途徑:a.酮還原酶或轉(zhuǎn)酮醇酶與轉(zhuǎn)氨酶偶聯(lián)，轉(zhuǎn)化底物酮生成手性氨基醇;b.轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化手性酮醇為手性氨基醇;c.酮還原酶轉(zhuǎn)化手性氨基酮為手性氨基醇。由此可見，轉(zhuǎn)氨酶在手性氨基醇的合成中起著舉足輕重的作用，利用轉(zhuǎn)氨酶制備手性氨基醇也越來越受到化學(xué)家的親睞。Smith等設(shè)計了一種簡潔的合成手性氨基醇的方法:轉(zhuǎn)酮醇酶和ω-轉(zhuǎn)氨酶偶聯(lián)，通過兩步反應(yīng)，成功制得(2S，3S)-2-氨基戊烷-1，3-二醇，此法可以實現(xiàn)(2S，3S)-2-氨基戊烷-1，3-二醇制備規(guī)模的生產(chǎn)。
Smithies等利用C.violaceumω-轉(zhuǎn)氨酶成功將1，3-二羥基-1-苯丙基-2-酮轉(zhuǎn)化為(2S)-2-氨基-1-苯基-1，3-丙二醇，而此酶對外消旋1，3-二羥基-1-苯丙基-2-酮并無選擇性(圖8)，因此其用于轉(zhuǎn)化底物酮醇制備手性氨基醇非常理想。雖然以上例子均令人欣喜，但是能夠高效制備手性氨基醇的轉(zhuǎn)氨酶種類并不多，尤其是能用于工業(yè)化生產(chǎn)的更是少，因此，新的酶以及更優(yōu)的反應(yīng)條件亟待開發(fā)。
4.4合成含氘氚標(biāo)記的手性胺
放射性氘、氚標(biāo)記的化合物對于了解藥物代謝和藥物動力學(xué)有重要作用。氘氚標(biāo)記的藥物在臨床前研究中，有利于研究者理解藥物的吸收和分布，對提高其活性有重要指導(dǎo)意義。傳統(tǒng)方法是從含氘氚標(biāo)記的底物直接合成手性胺，而Truppo等通過向反應(yīng)體系中加入氘、氚的方法直接由前手性酮制備得到了多種重氫標(biāo)記的手性胺，如含氘西他列汀的制備(圖9)。在60%的氘水和40%DMSO溶劑中，經(jīng)過20h轉(zhuǎn)化，20g·L-1的底物有82%轉(zhuǎn)化為含氘西他列汀，此西他列汀中所有氫均被置換為氘。利用轉(zhuǎn)氨酶CDX-017制備氚標(biāo)記的N-Cbz吡咯胺，在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，經(jīng)過2d反應(yīng)，N-Cbz吡咯胺中氚的富集程度達(dá)到280%，明顯高出統(tǒng)計值100%。以上例子說明轉(zhuǎn)氨酶同樣可以用于催化前手性酮制備多種重氫標(biāo)記的手性胺，其過程簡單可操作性強(qiáng)，是今后的發(fā)展趨勢。
5結(jié)語
近年來，轉(zhuǎn)氨酶在手性化合物合成中得到了廣泛應(yīng)用，其憑借綠色、高效的合成優(yōu)勢吸引了無數(shù)化學(xué)家的關(guān)注，人們采用化學(xué)-酶法結(jié)合的手段制備得到了大量手性胺。近五年來，從轉(zhuǎn)氨酶蛋白工程、表達(dá)、固定化、進(jìn)程工程到應(yīng)用，國內(nèi)外研究者都投入了大量的精力，也得到了很多可喜的成果。但是目前能夠用于工業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)氨酶并不多，因此新型酶的篩選以及反應(yīng)條件的優(yōu)化仍然是目前利用轉(zhuǎn)氨酶合成手性化合物面臨的兩大挑戰(zhàn)。開發(fā)新酶、改造現(xiàn)有酶以及研究轉(zhuǎn)氨酶過程工程等工作仍將是研究者們今后的研究重點，作者希望開發(fā)出更多可用于工業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)氨酶，以期搭建起手性胺的生物催化生產(chǎn)平臺。
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