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克隆柞蠶免疫相關(guān)基因克隆和誘導(dǎo)表達
昆蟲僅具有先天性免疫，不具有適應(yīng)性免疫，以下是小編搜集整理的一篇探究克隆柞蠶免疫相關(guān)基因克隆的論文范文，歡迎閱讀查看。
前言
昆蟲免疫主要是以產(chǎn)生的抗菌肽、抗病毒因子、凝集素、溶菌酶及蛋白酶抑制劑等多種活性物質(zhì)，配合多種功能的血細胞建立的一個開放防御體系。昆蟲僅具有先天性免疫，不具有適應(yīng)性免疫。昆蟲的先天免疫系統(tǒng)主要分為細胞免疫和體液免疫2大部分。體液免疫中轉(zhuǎn)錄因子Rel/NF—κB介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有Toll通路和Imd通路[1]，昆蟲主要通過這2種通路抵抗微生物的侵染。
研究發(fā)現(xiàn)，這2種通路通過激活不同的Rel/NF—κB家族成員調(diào)控不同抗菌肽基因的表達，其中Toll通路主要激活轉(zhuǎn)錄因子Dorsal和Dif，Imd通路主要激活轉(zhuǎn)錄因子Relish[1—5]。已知的Rel/NF—κB蛋白家族成員有8種，哺乳動物中有5種，昆蟲細胞中的3種分別是Dorsal、Dif和Relish。其中Dorsal和Dif無錨定重復(fù)序列，Relish有錨定重復(fù)序列。Rel/NF—κB蛋白的主要功能是調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡和生長發(fā)育，炎癥、癌癥、自身免疫疾病等病理過程與NF—κB的過度活化相關(guān)[6]。
由于Rel/NF—κB介導(dǎo)的Toll通路與Imd通路在無脊椎動物和脊椎動物中非常保守[1，7]，因此，對昆蟲Rel/NF—κB的研究不僅能夠系統(tǒng)了解昆蟲的先天免疫機制，而且可為深入了解高等動物的免疫機制及疾病防治提供重要依據(jù)。盡管Rel/NF—κB蛋白在先天免疫過程中起著非常重要的作用，但目前為止尚未見到有關(guān)柞蠶Rel/NF—κB家族成員的報道。本項研究利用生物信息學(xué)方法和分子生物學(xué)技術(shù)，以柞蠶蛹為試驗材料，克隆柞蠶免疫相關(guān)基因Apdorsal的全長cDNA序列，并將其編碼的氨基酸序列與其它物種的Rel/NF—κB氨基酸序列進行比對及構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測Apdorsal基因經(jīng)不同微生物誘導(dǎo)處理后的組織表達變化，為探討柞蠶的先天免疫機制提供參考。
1材料與方法
1。1材料和主要試劑
供試柞蠶品種為青6號，柞蠶蛹由遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所惠贈，4℃條件下保存?zhèn)溆谩４竽c桿菌（E。coli）Top10、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、畢赤酵母（Pichiapastoris）、柞蠶核型多角體病毒（ApNPV）等微生物由本實驗室保存。Trizol試劑，ReverseTranscriptaseM—MLV試劑盒，ExTaq酶，凝膠回收試劑盒，pMD18—T載體，T4—DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ，RLM—RACE試劑盒，SYBR—PrimeScript—RT—PCRKit（PerfectRealTime），均購自寶生物工程（大連）有限公司。
1。2柞蠶蛹總RNA提取及目的基因的RT—PCR擴增
取20μL培養(yǎng)過夜的E。coliTop10，注射到柞蠶蛹體內(nèi)，12h后解剖取脂肪體組織，用Trizol試劑提取柞蠶蛹脂肪體總RNA，然后按照ReverseTran—scriptaseM—MLV試劑盒說明書將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
根據(jù)GeneBank登錄的煙草天蛾Dorsal（登錄號：ADK39025）、家蠶Rel（登錄號：NP_001036896）和岡比亞按蚊Rel（登錄號：XP_310177）的cDNA序列設(shè)計簡并引物F（5′—TGCGARGGMCGSTCGG—3′）、R[（5′—CATKGCCTTCTTRTCG（T/A）AGATG—3′）]。簡并引物F/R進行cDNA的片段擴增，反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5min;94℃變性3s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán);72℃終延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后純化回收，連接到pMD18—T載體，轉(zhuǎn)化E。coliTop10感受態(tài)細胞，通過酶切鑒定篩選陽性克隆，送至寶生物工程（大連）有限公司進行測序分析。
1。3目的基因的RLM—RACE擴增
根據(jù)"1。2"中擴增得到的cDNA序列設(shè)計RACE擴增特異引物：Dor—5′RACEouterprimer（5′—CCAGGTTGTGCGAGTGAGGC—3′），Dor—5′RACEinnerprimer（5′—ATTGTAGGGTAGGTGCGGTTCTCG—3′），Dor—3′RACEouterprimer（5′—CTCGGCATCCAGTGCGTCAA—3′），Dor—3′RACEinnerprimer（5′—GGAATCACCCGC—AGAGCATC—3′）。5′—RACE和3′—RACE擴增分別按照RLM—RACE試劑盒說明書進行，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、純化回收后連接到pMD18—T載體，轉(zhuǎn)化E。coliTop10感受態(tài)細胞，通過酶切鑒定篩選陽性克隆，送至寶生物工程（大連）有限公司進行測序。
1。4目的基因的序列分析
測序結(jié)果用GenBank的BLAST比對，并用在線軟件Expasy進行蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和等電點分析。獲得的柞蠶Dorsal基因用在線軟件BLASTW進行氨基酸序列同源性比對，并用MEGA5。0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。
1。5不同微生物對柞蠶蛹的誘導(dǎo)處理及各組織總RNA提取
取30只健康柞蠶蛹隨機分為5組，每組6只，雌雄各3只。第1組為空白對照;第2組注射50μLE。coliTop10[D（600nm）=1。2，用無菌水稀釋10倍];第3組注射50μL枯草芽孢桿菌[D（600nm）=1。2，用無菌水稀釋10倍];第4組注射50μL畢赤酵母[D（600nm）=1。2，用無菌水稀釋10倍];第5組注射50μLApNPV（2×106mL—1病毒懸液，用無菌水稀釋10倍）。用一次性無菌注射器從柞蠶蛹第1腹節(jié)處注射，常溫孵育24h后，分別取柞蠶蛹的表皮、生殖腺、脂肪體、血淋巴、頭部、氣管6個組織器官，加液氮研磨成粉后，用Trizol試劑提取總RNA，然后按照ReverseTranscriptaseM—MLV說明書將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
1。6目的基因表達的實時熒光定量PCR檢測
1。6。1引物設(shè)計根據(jù)獲得的柞蠶Dorsal基因序列設(shè)計real—timePCR引物：QTF—ApdorsalA（5′—AG—GATCATTTACGCTGGAGGTACG—3′），QTR—ApdorsalA（5′—CTTCTCAGTTTCAACAGGTGTCCG—3′）;QTF—Ap—dorsalB（5′—TGCGCGAGTGTCAGTGTAGTTTGA—3′），QTR—ApdorsalB（5′—CGCAGTGTTCGCTTCCAAGAA—TCA—3′）。以組成型表達的柞蠶β—actin基因作為內(nèi)參，引物為：A3F（5′—ACCAACTGGGACGACATGGA—GAAA—3′），A3R（5′—TCTCTCTGTTGGCCTTTGGGT—TGA—3′）。
1。6。2實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR反應(yīng)采用熒光染料SYBRGreen（R）Ⅰ在RotorGene3000—6實時熒光定量基因擴增儀（上海天呈科技有限公司）上進行。按照SYBR—PrimeScript—RT—PCRKit說明書配制25μL反應(yīng)體系：cDNA模板2μL，2×SYBRPremixExTaq酶12。5μL，10μmol/L正向引物0。5μL，10μmol/L反向引物0。5μL，RNaseFreedH2O9。5μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s，30個循環(huán)（95℃變性3~5s，60℃退火/延伸20s）。
反應(yīng)結(jié)束后，20min緩慢升溫繪制熔解曲線，利用BotorGene6軟件的2—ΔΔCt方法[8]對目標(biāo)基因的表達水平進行分析。
2結(jié)果與分析
2。1Apdorsal基因的獲得與序列特征
利用RLM—RACE擴增從柞蠶蛹脂肪體中克隆得到了2個Apdorsal基因的cDNA序列，分別命名為ApdorsalA和ApdorsalB（登錄號：JF488068、JF488069）。其中，ApdorsalA的cDNA全長1872bp，有一個1158bp的開放閱讀框（266~1423nt），編碼386個氨基酸，該cDNA還包括265bp的5′端非編碼區(qū)和449bp的3′端非編碼區(qū);ApdorsalB的cDNA全長1860bp，有一個1008bp的開放閱讀框（404~1411nt），編碼336個氨基酸，該cDNA還包括403bp的5′端非編碼區(qū)和449bp的3′端非編碼區(qū)。
推導(dǎo)的氨基酸序列中都包含Rel/NF—κB蛋白家族的特征區(qū)RHD，但是3′端沒有Dorsal蛋白通常所具有的TD轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（圖1）。
將ApdorsalA蛋白與其它物種的Rel/NF—κB家族蛋白進行全長氨基酸序列比對，結(jié)果顯示柞蠶ApdorsalA蛋白與Dorsal、Dif、P65都屬于無錨定重復(fù)序列的一類蛋白，ApdorsalA與煙草天蛾MsDorsal、家蠶BmRelA、岡比亞按蚊Gambif、皺紋盤鮑AbRel、人Hsp65、褐家鼠Rnp65、果蠅DmDif、家蠶BmReish1和果蠅DmRelish的序列相似度分別為78%、70%、56%、48%、45%、45%、41%、32%、34%。
應(yīng)用MEGA5。0軟件構(gòu)建柞蠶ApdorsalA蛋白與其它物種Rel/NF—κB蛋白的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示ApdorsalA蛋白與煙草天蛾Msdorsal、家蠶BmRelA蛋白有較近的親緣關(guān)系（圖2）。
2。2Apdorsal基因mRNA組織分布及不同微生物誘導(dǎo)的表達變化
為了進一步了解Apdorsal基因在柞蠶不同組織中的表達情況及Apdorsal是否參與了對不同微生物的免疫應(yīng)答反應(yīng)，利用real—timePCR技術(shù)以柞蠶β—actin基因為內(nèi)參檢測各種組織中ApdorsalA和ApdorsalB基因mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果表明2個Apdorsal基因mRNA在柞蠶蛹各組織中都有轉(zhuǎn)錄，在表皮和氣管中的轉(zhuǎn)錄水平最高，在脂肪體和頭部中的轉(zhuǎn)錄水平次之，在血淋巴中的轉(zhuǎn)錄水平較低。柞蠶蛹脂肪體中的Apdorsal基因mRNA經(jīng)ApNPV誘導(dǎo)處理后的轉(zhuǎn)錄水平最高，經(jīng)畢赤酵母和枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)處理后的轉(zhuǎn)錄水平次之，經(jīng)E。coli誘導(dǎo)處理后的轉(zhuǎn)錄水平最低（圖3）。
3討論
本實驗克隆得到了2個編碼柞蠶Dorsal蛋白的cDNA序列，二者的5′端部分序列不同，推導(dǎo)的氨基酸序列僅僅是N端的50個氨基酸殘基有差異。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于可變剪切的結(jié)果，在其它物種的研究中也出現(xiàn)過由于可變剪切編碼不同Rel/NF—κB蛋白的現(xiàn)象，例如家蠶BmRelA和BmRelB的氨基酸序列也僅是N端52個氨基酸殘基有差異[9]。本實驗克隆的2個Apdorsal基因的編碼蛋白質(zhì)都有典型的Rel/NF—κB蛋白特征，N端含有由293個氨基酸組成的Rel同源區(qū)（RHD），其中包括核定位信號（NLS）和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域等基序。ApdorsalC末端與果蠅和家蠶的Relish[10—11]不同的是該區(qū)域中沒有錨定重復(fù)序列。雖然Apdorsal的結(jié)構(gòu)特征與BmRelA[9]和Gambif1[12]類似，但不具有BmRelA和Gambif1的亮氨酸鋅指結(jié)構(gòu)與脯氨酸富集區(qū)。值得注意的是，Apdorsal有一個相對較短的C末端片段，這與典型的Dorsal蛋白不同，而且Apdorsal也沒有典型的Dorsal轉(zhuǎn)錄激活域，這可能是可變剪切造成的[13]。
從系統(tǒng)進化樹中可以看出，Apdorsal與家蠶BmRelA和煙草天蛾Msdorsal有很近的親緣關(guān)系，同屬于Rel/NF—κB蛋白家族的Dorsal類，表明它們可能起源于同一個祖先。應(yīng)用real—timePCR技術(shù)檢測到2個Apdorsal基因在柞蠶蛹脂肪體、血細胞、氣管、表皮、生殖腺和頭部6個組織器官中都有表達，體現(xiàn)了該蛋白質(zhì)在柞蠶中的多功能性[6]。Apdorsal基因在表皮和氣管中的表達量最高，在脂肪體和頭部中的表達量次之，在血淋巴中的表達量較低，這是由于表皮是昆蟲抵御微生物感染的第一道防線，而脂肪體是參與免疫應(yīng)答的重要組織器官。用不同微生物誘導(dǎo)處理柞蠶蛹后，部分組織中Apdorsal基因的表達量比空白對照偏低，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是注射處理過程中物理性傷害產(chǎn)生的抑制作用，這與家蠶注射NaCl溶液后各組織中的BmToll9基因的表達量出現(xiàn)降低的結(jié)果相一致[14]。
柞蠶蛹脂肪體中的Apdorsal基因經(jīng)ApNPV誘導(dǎo)處理后的表達水平最高，經(jīng)畢赤酵母和枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)處理后的表達水平次之，經(jīng)E。coli誘導(dǎo)處理后的表達水平最低。該結(jié)果說明柞蠶蛹脂肪體中的Apdorsal可能與對病毒、真菌、革蘭陽性菌的免疫有關(guān)，而與對革蘭陰性菌的免疫無關(guān)。這與Dorsal蛋白在Toll通路中對革蘭陽性菌和真菌侵染具有抵抗作用的研究結(jié)果一致[1，8]。對于病毒侵染昆蟲后是否激活了NF—κB信號通路尚無定論。已有文獻報道Toll樣受體（TLRs）參與了病毒的識別，進而激活Toll通路[15];Zambon等[16]也報道果蠅在抵抗病毒侵染的過程中通過激活Toll通路產(chǎn)生抗菌肽（AMPs），但不是通過AMPs抗病毒，而是由Toll通路激活細胞免疫殺滅病毒，說明病毒侵染可能會使Toll通路中的Dorsal的表達量增加。
這與本實驗對柞蠶蛹注射ApNPV懸液后脂肪體中的Apdorsal基因的表達量增加的結(jié)果相一致。然而Hirai等[17]用病毒侵染柞蠶后未檢測到抗菌肽Attacin基因的表達，認(rèn)為病毒不能激活NF—κB信號通路。對于病毒是否激活NF—κB信號通路及病毒侵染使Apdorsal表達量增加的分子機制仍需繼續(xù)探究。
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