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脂肪源干細(xì)胞上皮分化淺說在喉組織工程中的應(yīng)用
脂肪源干細(xì)胞上皮分化在喉組織工程中的應(yīng)用
聲帶瘢痕是一個(gè)較難解決的臨床問題，尚缺乏有效的治療手段，目前其主要的治療方法是向聲帶中注射填充物或細(xì)胞，試圖恢復(fù)聲帶淺層的振動(dòng)性。聲帶振動(dòng)受損主要是由于固有層細(xì)胞外基質(zhì)的中斷、膠原沉積增多、彈性纖維的丟失等引起。有證據(jù)表明聲帶注射細(xì)胞或基質(zhì)對(duì)恢復(fù)聲帶黏膜波的作用是有限的。另外，從人的聲帶中獲取成纖維細(xì)胞比較困難�，F(xiàn)有的組織工程方法是將聲帶的成纖維細(xì)胞包被在一系列的支架上。用自體細(xì)胞來源的組織結(jié)構(gòu)工程代替聲帶被覆黏膜可能成為嚴(yán)重聲帶瘢痕的治療方式。實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)的第一步是構(gòu)建類似于聲帶固有層和上皮層的三維細(xì)胞群基質(zhì)。切除聲帶瘢痕后，用新的有組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)和上皮作為替代物，改善聲帶的振動(dòng)功能。
本研究便是介紹一種新的組織工程方法來構(gòu)建聲帶被覆黏膜的替代物，以便恢復(fù)聲帶固有層和上皮的振動(dòng)功能。通過脂肪抽吸分離獲得的脂肪源干細(xì)胞是一種多功能干細(xì)胞，作為一種自體間質(zhì)細(xì)胞的來源，已被廣泛用來產(chǎn)生軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和纖維細(xì)胞。脂肪源干細(xì)胞與骨髓源間質(zhì)干細(xì)胞具有相似的遺傳特征，可以分化成外胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞。本研究假設(shè)脂肪源干細(xì)胞在氣體界面和特異性細(xì)胞因子的作用下可以分化成上皮細(xì)胞，而遠(yuǎn)離氣體界面的細(xì)胞則可以分化為成纖維細(xì)胞。其方法是從UCLA血庫獲取冷沉淀物，一7O℃保存?zhèn)溆谩⒔鈨龅睦涑恋砦�、牛凝血酶溶液以及�?xì)胞懸液按4：1：1混合形成纖維蛋白一脂肪來源的干細(xì)胞膠。在Transwell培養(yǎng)基板上形成凝膠，將一定量的細(xì)胞懸液直接加在膠上形成氣體界面。
可見在特定的生長因子和氣體界面的培養(yǎng)下，整個(gè)三維培養(yǎng)基中可見膠原產(chǎn)生，在接近上皮層的細(xì)胞中膠原沉積較多；在表皮生長因子和氣體界面培養(yǎng)下，E一鈣黏蛋白(一種上皮細(xì)胞標(biāo)志物)在三維培養(yǎng)基中陽性表達(dá)；在表皮生長因子和氣體界面下培養(yǎng)8天后，培養(yǎng)基表面的細(xì)胞中細(xì)胞角蛋白呈陽性表達(dá)；在表皮生長因子的作用下培養(yǎng)14天后，接近氣膠交界的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)較多的E一鈣黏蛋白表達(dá)，包埋在基質(zhì)中的細(xì)胞則無E一鈣黏蛋白的表達(dá)，而波形蛋白陽性表達(dá)較明顯。波形蛋白是一種在間質(zhì)細(xì)胞系中表達(dá)的細(xì)胞骨架蛋白，聲帶固有層中的成纖維細(xì)胞陽性表達(dá)波形蛋白。在三維培養(yǎng)基中表達(dá)波形蛋白的細(xì)胞位于表達(dá)E一鈣黏蛋白細(xì)胞的深層。
本研究構(gòu)建了聲帶黏膜的組織工程替代物，三維的纖維蛋白和脂肪源干細(xì)胞的水凝膠與聲帶的固有層和黏膜層有著相似的顯微結(jié)構(gòu)和特性。在本研究中，成人脂肪源干細(xì)胞可以雙向分化成上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞系，并且具有組織結(jié)構(gòu)，表皮生長因子和氣體界面是上皮分化的必備條件。本研究結(jié)果初步表明，利用組織工程制作聲帶替代物是可行的。
應(yīng)用肝細(xì)胞生長因子凝膠修復(fù)慢性聲帶瘢痕
慢性聲帶瘢痕(chronic vocal fold scar)一般繼發(fā)于喉部創(chuàng)傷、炎癥或者手術(shù)之后，由于聲帶固有層組織結(jié)構(gòu)破壞而使聲帶生物力學(xué)功能發(fā)生改變，可導(dǎo)致聲門功能障礙和嚴(yán)重的發(fā)聲困難。以往組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，聲帶瘢痕存在細(xì)胞外組織結(jié)構(gòu)的改變，如：I型膠原沉積物密集或者紊亂，彈性蛋白和核心蛋白多糖減少，纖連蛋白增加以及透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)降低等。這些組織學(xué)變化說明慢性聲帶瘢痕中成纖維細(xì)胞的表型合成異常，從而導(dǎo)致聲帶組織僵硬，因此，若使聲帶瘢痕恢復(fù)振動(dòng)功能，改變纖維母細(xì)胞的表型以及修復(fù)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)是必需的。
肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一種多功能的多肽，其在胚胎形成、血管生成、器官重建和創(chuàng)傷修復(fù)方面起重要作用。HGF具有抗纖維化功能，在動(dòng)物模型的研究中已證實(shí)其對(duì)肝、腎、肺的纖維組織具有預(yù)防纖維化及溶解纖維組織的作用。另有研究表明HGF具有治療聲帶瘢痕的作用，其可增加成纖維細(xì)胞中透明質(zhì)酸的產(chǎn)生并降低膠原沉積。
以往研究表明HGF對(duì)聲帶急性損傷具治療作用，但存在HGF在聲帶注射位點(diǎn)擴(kuò)散過快、存留時(shí)間太短的缺點(diǎn)。本研究建立一種新型的凝膠藥物釋放系統(tǒng)(drug deliverysystem，DDs)以減緩HGF在聲帶內(nèi)的釋放、擴(kuò)散，并通過犬動(dòng)物模型觀察HGF—DDS對(duì)慢性聲帶瘢痕的修復(fù)作用。
實(shí)驗(yàn)用水凝膠由戊二醛和酸明膠交聯(lián)化學(xué)反應(yīng)而獲得，將1 gg的HGF加入水凝膠中制備成HGF水凝膠。選用8只米格犬作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在直達(dá)喉鏡下將一側(cè)聲帶固有層撕剝達(dá)肌層使聲帶瘢痕化，對(duì)側(cè)聲帶作為正常對(duì)照。6個(gè)月后，將0．5 ml HGF水凝膠(含HGF 1 ug)液通過經(jīng)口聲帶注射器注入實(shí)驗(yàn)組4只犬的瘢痕聲帶上皮下(HGF治療組)；另將0．5 ml PBS水凝膠液(含PBS 1 g)注入另四只狗的瘢痕側(cè)聲帶內(nèi)(對(duì)照組)，1個(gè)月后再注射1次以強(qiáng)化療效。
術(shù)后9個(gè)月所有犬安樂死，取喉體進(jìn)行聲帶振動(dòng)檢測及組織學(xué)檢查。應(yīng)用壓力傳感器檢測聲門下壓力，通過高速數(shù)字圖像系統(tǒng)記錄聲帶振動(dòng)狀態(tài)，以發(fā)聲壓力閾值(pho—nation threshold pressure，PTP)評(píng)估聲帶黏膜振動(dòng)，并經(jīng)公式計(jì)算振幅率(amplitude ratio，AR)及標(biāo)準(zhǔn)聲門間隙(normalizedglottal gap，NGG)。光學(xué)顯微鏡下觀察每側(cè)聲帶固有層膠原、彈性蛋白及透明質(zhì)酸，通過檢測固有層厚度判斷瘢痕收縮程度。
振動(dòng)學(xué)檢查結(jié)果表明：HGF治療組聲帶黏膜振動(dòng)明顯好于對(duì)照組，對(duì)照組損傷側(cè)聲帶呈弓形并且黏膜振動(dòng)受限。
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