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RP?HPLC法測(cè)定鉤藤煎劑中鉤藤堿含量及變化
【摘要】 [目的]測(cè)定鉤藤中鉤藤堿在沸水后下煎藥法中煎出量及變化規(guī)律。[方法]采用RP?HPLC法,Hypersil BDS C18柱，(150mm×4.6mm,5μm)，以甲醇∶水(70∶30)為流動(dòng)相，流速1.0ml/min，波長(zhǎng)254nm，柱溫25℃。[結(jié)果]鉤藤堿在0.19μg～0.95μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好r=0.9990。[結(jié)論]鉤藤在沸水后下煎藥法中，其鉤藤堿在湯藥中的含量在11.4min達(dá)高峰，其后湯藥中鉤藤堿的含量逐漸降低。
【關(guān)鍵詞】 鉤藤;鉤藤堿;反相高效液相色譜法
RP?HPLC Method Measure the Contents and The Regularity of Rhychophyline in Ramulus Uncariae Cum Uncis Liu Qinghua, Ge Erning Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou (310053), China
Abstract：[Objective]To measure the contents of rhychophyline in uncaria,and its regularity of variety with decoction time. [Methods]RP?HPLC method was used.The chromatographic conditions were listed below: Hypersil?BDS C18 column (150mm×4.6mm.5μm), amobine phase composed of metranol?water(70∶30),a flow rate of 1ml /min and wave lengths was 254nm,column temperature was 25 ℃. [Results]In the range of 0.19μg ～0.95μg, the linear was very well between the content of rhychophyline and peak area. [Conclusion]The contents of rhychophyline in decoction reached the peak at 11.4min after uncaria was added in boiling water.
Key words：Ramulus Uncariae Cum Uncis; Rhychophyline; RP?HPLC
鉤藤，性味甘涼。具有清熱平肝，息風(fēng)止痙的功效。臨床主治頭痛、眩暈、驚癇抽搐等癥[1]。本文對(duì)鉤藤采取沸水后下的煎藥方法，分時(shí)采樣，再用HPLC法分別測(cè)定在不同時(shí)間段鉤藤堿在湯藥中的含量及變化規(guī)律。
1 儀器與試藥
美國(guó)Waters高效液相色譜儀，484紫外檢測(cè)器，510泵，浙江大學(xué)N2000色譜工作臺(tái)，甲醇為色譜醇，水為雙蒸水。鉤藤堿對(duì)照品購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司(批號(hào)：071209)，鉤藤藥材購(gòu)于浙江中強(qiáng)醫(yī)藥有限公司。
2 色譜條件
色譜柱：Hypetsil BDS C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相：甲醇∶水=70∶30，流速：1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm，柱溫：25℃。
3 方法與結(jié)果
3.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取鉤藤堿對(duì)照品4.75mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得對(duì)照品儲(chǔ)備液。將對(duì)照品儲(chǔ)備液按不同比例稀釋?zhuān)謩e得質(zhì)量濃度為47.5μg/ml、38.0μg/ml、28.5μg/ml、19.5μg/ml、9.5μg/ml的溶液，待用。下載論文
3.2 供試品溶液制備 稱(chēng)取鉤藤藥材15g 備用。取1只200 ml的燒杯加入100ml水，調(diào)節(jié)電壓使電爐處于高溫，武火至沸，迅速加入鉤藤藥材15g，開(kāi)始計(jì)時(shí)，于1min開(kāi)始取樣，然后在30min內(nèi)，每隔2min取1次樣，每次2ml，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并對(duì)應(yīng)混合3次所取樣品溶液，共提取15種待測(cè)樣品經(jīng)離心，取上清液，再經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾過(guò)，取續(xù)慮液，即得供試品液，備用。
3.3 線性關(guān)系考察 精密吸取上述各種對(duì)照品溶液各20μl，進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖(見(jiàn)圖1)，以峰面積y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量x(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算得回歸方程為y=1130.1763x-53.1639，r=0.9990(n=5)。結(jié)果表明，鉤藤堿進(jìn)樣量在0.19μg～0.95μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。
A B
A鉤藤堿對(duì)照品 B鉤藤樣品1鉤藤堿
圖1 色譜圖3.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取鉤藤堿對(duì)照品溶液20μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD為1.12%。
3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液分別在0h、2h、4h、6h、8h、16h，測(cè)定鉤藤堿峰面積，計(jì)算RSD為2.78%，表明供試品溶液在16h內(nèi)穩(wěn)定。
3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱(chēng)取同一批號(hào)(200804)鉤藤藥材15g6份，在同一溫度、加水量及煎藥法下，取樣處理后，測(cè)定鉤藤堿峰面積積分值，RSD為2.18%。
3.7 樣品含量測(cè)定 精密吸取各時(shí)間段提取的供試品溶液20μl進(jìn)樣，記錄色譜圖(見(jiàn)圖1)，根據(jù)峰面積計(jì)算各供試品中鉤藤堿含量，以煎藥時(shí)間為橫坐標(biāo)，樣品中鉤藤堿溶出量為縱坐標(biāo)，繪制趨勢(shì)圖(見(jiàn)圖2)，以趨勢(shì)圖為基準(zhǔn)，采用二次曲線擬合法求得被測(cè)溶液中鉤藤堿隨時(shí)間變化方程：y=-0.0079t2+0.1796t+0.3678，微分得dy/dt=-0.0158t+0.1796。當(dāng)dy/dt=0時(shí)，t=11.4。由此得知，在湯藥中鉤藤堿含量在11.4min達(dá)到高峰，其后在湯藥中的鉤藤堿含量逐漸下降。
圖2 鉤藤堿含量隨煎煮時(shí)間的變化規(guī)律
4 討論
4.1 實(shí)驗(yàn)中曾考察了甲醇∶水=90∶10、80∶20、65∶35等多種流動(dòng)相比例，鉤藤堿分離效果均不理想或者出峰時(shí)間較晚，所需分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。當(dāng)采用甲醇∶水=70∶30的比例的時(shí)，鉤藤堿峰形對(duì)稱(chēng),分離度較理想，被測(cè)組份保留時(shí)間適中。
4.2 由RP?HPLC分析得知，鉤藤在沸水后下煎煮過(guò)程中，(1)在湯藥中的鉤藤堿含量在11.4min達(dá)到高峰。(2)煎煮時(shí)間在10min時(shí)，其鉤藤堿的含量達(dá)到90%。(3)煎煮時(shí)間在13min時(shí)，在湯藥中鉤藤堿含量下降了10%，煎藥時(shí)間至25min后，湯藥中的鉤藤堿的含量降至高峰時(shí)的50%以下。由以上分析得知鉤藤在沸水后下煎煮法中，其煎煮時(shí)間最好控制在10min～13min，該煎藥時(shí)間段內(nèi)湯藥中的有效成份含量會(huì)相對(duì)較高。以上結(jié)果對(duì)臨床科學(xué)合理煎藥具有一定指導(dǎo)意義。
【參考文獻(xiàn)】
[1] 高學(xué)敏.中藥學(xué)[M].新世紀(jì)二版.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2007:407?408.
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