老年腦標本5羥色胺轉運體的表達

作者：石葛明 王磊　李雙成　崔慧先　劉硯星　王偉
【摘要】 目的 觀察老年人腦標本5羥色胺轉運體的表達。方法 以免疫放射自顯影技術顯示5羥色胺轉運體在人腦標本的分布和強度。結果 5羥色胺轉運體免疫反應標記強度在老年組明顯降低，中縫背核、尾狀核、殼及整個中腦的5羥色胺轉運體免疫反應強度比青年組分別降低了16?22%(P＜0?05)、17?64%(P＜0?05)、31?25%(P＜0?05) 和25?58%(P＜0?01)，具有顯著差異。結論 老年人腦標本 5羥色胺轉運體的低表達表明在衰老過程中5羥色胺轉運體隨年齡增加而表達減少。
【關鍵詞】 5羥色胺轉運體；免疫放射自顯影；腦
　5羥色胺轉運體（serotonin transporter, SERT）是位于5羥色胺能神經末梢的一種膜蛋白〔1〕，其表達變化直接影響5羥色胺能神經元參與的神經活動。SERT作為常用抗抑郁藥物的作用靶點〔2〕，其在老齡后的蛋白表達變化報道較少。目前關于SERT老齡改變的結果多基于SERT配基的放射自顯影〔3,4〕及神經顯像研究〔5,6〕，因受研究方法和所使用SERT配基特異性不高的限制，研究結果多不一致。本研究擬利用免疫放射自顯影技術對老齡人腦標本腦內SERT蛋白的表達進行分析，確定SERT 蛋白表達的老齡改變，以期為今后臨床應用正電子發(fā)射計算機體層掃描（PET) 及單光子發(fā)射計算機體層掃描（SPECT）檢測腦內SERT變化，診斷老年相關性疾病提供實驗依據。
　　1 對象和方法
　　1?1 對象
　　將死于非中樞神經系統(tǒng)疾病的人腦標本12例分為兩組：青年組6例，年齡24～36歲，平均（32?67±4?41）歲；老年組6例，年齡62～75歲，平均（69?67±4?8）歲。
　　
　　1?2　取材
　　腦標本在其死亡后12～22 h自顱內取出。按需要將腦切成厚約5 mm腦塊，經10%甲醛浸泡固定（96 h）、常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋。
　　1?3 免疫放射自顯影
　　石蠟塊行常規(guī)切片（8 μm）、裱片及脫蠟入水；0?01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH 6?0）抗原修復、0?2% Triton?X?100、8% 正常羊血清預處理（4℃，1 h）；1∶100小鼠單克隆抗SERT抗體孵育（4℃，48 h）；125I標記的羊抗小鼠IgG（1 μCi/ml）室溫孵育1 h。125I標記的切片經洗片、風干，與貼有125I?標準、14C?標準的載片置于放射自顯影盒內，載片上覆以 Biomax MS 膠片 (REF 832 6886)，曝光10 d（腦干）、14 d（紋狀體區(qū)）行顯影、定影。對照實驗不用一抗，其余步驟相同。以固藍復染上述切片，用于圖像分析時的結構辨認。
　　1?4 圖像密度分析
　　掃描膠片（300 dpi）以TIFF格式儲存,用AIS 軟件測量感興區(qū)密度。按Paxinos等編著的人腦圖譜, 鏡下辨認復染切片的核團，用鼠標勾畫相應核團圖像邊界。以125I?標準校正的 14C?標準dards曲線測量邊界內圖像密度，計算膠片圖像與切片對應核團的125I強度。所得值減去對照組相同核團背景標記值為特異性標記結果（nCi/mg）。相關數據采用t檢驗。
　　2 結果
　　2?1 SERT標記的一般觀察
　　在所觀察的腦區(qū)中，中腦除大腦腳底和紅核以外的大部分區(qū)域均含有SERT免疫反應標記信號；端腦的尾狀核、殼以及蒼白球亦有SERT免疫反應標記信號存在。在這些標記區(qū)域中，以中腦中縫背核的SERT標記信號最強。兩組無SERT標記信號分布上的差異，但存在SERT標記信號強度的區(qū)別，老年組SERT標記強度低于青年組（圖1）。
　　2?2 SERT標記的強度分析
　　見表1。除蒼白球外，老年組中縫背核、尾狀核及殼的SERT免疫反應強度比青年組相同區(qū)域分別降低了16?22%、17?64%、31?25%（P＜0?05）；整個中腦水平降低了25?58%(P＜0?01)。所觀察的對象中縫背核、尾狀核、殼以及中腦每十年分別降低大約3?24%、3?53%、6?25%和5?12%。表1 5羥色胺轉運體在老年腦標本不同腦區(qū)的標記強度(略)
　3 討 論
　　位于5羥色胺能神經末梢的膜蛋白SERT〔1〕通過攝取突觸間隙的5羥色胺而中止其對突觸后神經元的作用，是反映5羥色胺能神經元功能活動的重要指標〔7〕。我們通過對腦內SERT投射源區(qū)(中縫背核)和SERT投射靶區(qū)（尾狀核、殼和中腦等）的免疫放射自顯影研究，發(fā)現老年組SERT蛋白表達明顯低于青年組，表現出隨年齡的增加而表達降低，其蛋白表達降低程度相當于每十年減少大約3%～6%。這一研究結果與近年利用SPECT/PET研究在體健康人腦內所觀察到的結果基本相符〔5,6〕，即腦干?間腦SERT和配基的結合信號與年齡增加呈負相關(SERT?配基結合信號每十年降低4%～10%)。有研究表明，SERT在腦內的變化與人類的神經精神疾病密切相關〔8,9〕。躁狂病人中腦SERT?〔123I〕β?CIT結合信號明顯增加〔9〕，抑郁病人則出現不同腦區(qū)SERT?〔123I〕β?CIT結合信號的顯著降低〔8〕。有實驗證實，隨著人類壽命的延長、老齡人口的增加，老年人出現抑郁癥狀的頻率增高〔10，11〕，老年人易患抑郁是否與其較低的SERT蛋白表達有關值得進一步的深入研究。近年分析SERT在腦內變化的年齡關系，主要利用SPECT/ PET〔11,12〕的配基神經顯像技術觀察活體〔5,6〕以及利用配基放射自顯影方法觀察人腦標本〔3,4〕的SERT結合位點信號強度的改變，與使用這兩種方法的研究相比，我們采用以SERT特異性抗體識別抗原的免疫放射自顯影方法，檢測的是腦組織內蛋白含量的變化，可真實反映腦內SERT蛋白含量的改變，而前兩種方法檢測腦內SERT標記信號強度變化的方法屬受體與配基的結合，所得結果并非SERT蛋白的表達差異。有研究表明，當腦內SERT結合位點強度（密度）改變時，SERT蛋白含量仍可保持在正常的表達水平〔12〕。另外配基神經顯像技術所使用的配基主要是β?CIT，β?CIT除結合SERT外，還能結合腦內DAT，腦內大部分區(qū)域都有

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