心臟缺血再灌注損傷后一氧化氮合酶的變化

作者：唐省三,馬亞珍,劉紅云,朱曉琴,雷水生
【關鍵詞】 再灌注損傷
Changes of nitric oxide synthesis in cardiac ischemia reperfusion injury

　　【Abstract】 AIM: To investigate the expression and function of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and inducible NOS (iNOS) during ischemiareperfusion injury (IRI) in rat hearts. METHODS: IRI was induced by clamping the left anterior descending (LAD) of coronary artery for 1h, followed by reperfusion. Nitric oxide synthase (NOS) activities of hearts was assayed at various time points and NOS protein levels as well as NOS mRNA expression were determined by Western blot and RTPCR methods respectively. RESULTS: eNOS activity, protein level and mRNA expression all increased after 26 h of IRI and decreased after 3 d of IRI and then gradually returned to basal level after 21 d. iNOS was expressed after 12 h of IRI and reached the peak level at day 3 after IRI and then decreased to basal level. CONCLUSION: The expression of iNOS is high while that of eNOS is low during cardiac ischemiareperfusion injury. Proper regulation of eNOS and iNOS expression may be therapeutically helpful in treating patients with cardiac ischemiareperfusion injury.
　　【Keywords】　reperfusion injury; nitric oxide synthase; heart
　　【摘要】 目的： 研究大鼠心臟缺血再灌注損傷(IRI)過程中一氧化氮合酶(NOS) 的變化規(guī)律及其作用. 方法： 制作SD大鼠心臟IRI動物模型,用同位素法測定正常及IRI心組織的NOS活性；用Western印跡和逆轉錄PCR法分析eNOS和iNOS 在IRI過程中蛋白和基因表達的變化.結果： 心臟eNOS活性、蛋白和mRNA表達水平，在缺血再灌注2~6 h后均增高，3天后降低，21天后逐漸恢復到正常水平. 心臟iNOS活性、蛋白和mRNA表達水平，在缺血再灌注12 h后開始表達，3天達高峰，然后逐漸降至正常水平. 結論： 單純?nèi)毖�并不引起NOS 活性的明顯變化,再灌注損傷使NOS的mRNA表達增加,酶的合成增多,活性增高.
　　【關鍵詞】　再灌注損傷；一氧化氮合酶；心臟
　
　　0引言
　　一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)在心肌缺血再灌注中起著極其重要的作用［1］.一氧化氮合酶(nitric oxide synthesis, NOS) 可分為原生型(cNOS) 和誘生型(iNOS) .cNOS 依存在的部位分為神經(jīng)型(nNOS) 和內(nèi)皮型(eNOS).心臟組織內(nèi)的NOS同功酶有兩種,即eNOS和iNOS. 參與炎性反應及急性排斥反應等病理過程［2］. 我們研究eNOS和iNOS在心臟IRI中的變化規(guī)律及其作用,為其防治提供理論基礎.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　SD大鼠購自華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心；iNOS Assay Kit 購自南京建成生物技術研究所；一抗羊抗大鼠iNOS或eNOS mAb 購自武漢博士德公司； HRP標記的兔抗羊IgG二抗購自Sigma 公司； Trizol裂解液、Oligo(dT) 、TaqDNA聚合酶和逆轉錄酶(AMV RT)均為美國Gibco 公司產(chǎn)品；eNOS和iNOS 引物及內(nèi)參照由上海博亞生物技術公司合成. 冠狀動脈阻斷再灌注模型制備［3］后在不同的再灌注時間點處死大鼠,收集心臟標本,液氮急凍, -70℃保存?zhèn)溆?
　　1.2方法
　　取雄性200～220 g SD大鼠120只,隨機分為缺血再灌注（IRI）組和假手術（對照,Control）組，每組60只，在再灌注不同時間點（0, 0.5, 1, 2, 6, 12 h和1, 3, 7, 14, 21, 30 d ）處死大鼠，每組每個時間點各5只.
　　1.2.1NOS活性的測定IRI組大鼠取左室缺血區(qū)心肌0.2 g,對照組大鼠取左室相應區(qū)心肌0.2 g,采用iNOS Assay Kit進行測定. 心組織NOS活性的測定采用3［H］精氨酸同位素法［4］ , 心組織在4℃含有1 mmol/L leupeptin, 2 mmol/L aprotonin, 1 mmol/L　phenylemthylsulfonyl fluoride, 1 mmol/L DTT, 1 ml/L Triton X100的30 mmol/L HEPES緩沖液中勻漿,反應液為30 mmol/L HEPES緩沖液(pH 7.4),含1 mmol/L CaCl2, 100 mmol/L NADPH, 300 mmol/L tetrahydrobiopterin, 1 mmol/L dithiothreitol,以40 mmol/L L3H精氨酸(37 kBq/反應液)為反應底物,在37℃下反應30 min,用200 μL 含100 mmol/L EGTA的終止液終止反應,反應體系過5 cm的Dowex離子交換層析柱,加閃爍液后讀取放射性記數(shù). 蛋白定量用Bradford法,NOS活性用每克蛋白秒fmol（即fkat/g）表示.
1.2.2Western印記檢測iNOS和eNOS蛋白表達IRI組大鼠取左室缺血區(qū)心肌0.2 g,對照組大鼠取左室相應區(qū)心肌0.2 g,以5∶1(V/m)比例置勻漿緩沖液（含50 mmol/L Tris pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 5 g/L α

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