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全氟辛烷磺酸對大鼠興奮性氨基酸影響
【摘要】 目的 探討全氟辛烷磺酸（PFOS）與大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性氨基酸的時間反應(yīng)關(guān)系。方法 將成年Wistar大鼠隨機(jī)分為1個對照組和4個實(shí)驗(yàn)組［25mg/（kg· bw），染毒后2,4,8,24h］；用PFOS對成年Wistar大鼠經(jīng)口1次染毒；對照組給予等體積的2%吐溫-80溶液。高效液相色譜法（HPLC）測定腦組織中谷氨酸、天冬氨酸、γ-氨基丁酸及甘氨酸含量變化。結(jié)果 谷氨酸2,4,8h含量分別為（0.89±0.162），（0.75±0.276），（0.84±0.542）μmol/（g·protein），與對照組（1.30±0.063）μmol/（g·protein）比較，差異有學(xué)意義(P＜0.05）。天冬氨酸無顯著變化。甘氨酸8,24h含量分別為（1.24±0.352），（1.09±0.215）μmol/（g·protein），與對照組（1.54±0.120）μmol/（g·protein）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05）。γ-氨基丁酸含量24h為（1.68±0.188）μmol/（g·protein），與對照組（2.03±0.370）μmol/（g·protein）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05）。結(jié)論 低劑量PFOS染毒后中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)先抑制后興奮的癥狀可能與興奮性氨基酸的參與有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】 全氟辛烷磺酸
全氟辛烷磺酸（Perfluorooctane sulfonate，PFOS）是近年來引起學(xué)者密切關(guān)注的新發(fā)現(xiàn)的持久性環(huán)境有機(jī)污染物，具有難溶性、生物蓄積性和沿食物鏈向高位營養(yǎng)級的生物體內(nèi)富集的作用〔1〕。研究表明,PFOS可引起恒河猴體重減輕、血液多種生理生化指標(biāo)異常、肝細(xì)胞空泡化等改變〔2〕。PFOS的污染已遍及全球生態(tài)系統(tǒng)〔3〕。本實(shí)驗(yàn)旨在對低劑量PFOS暴露條件下，大鼠腦組織中的谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸含量的時間變化進(jìn)行測定，探討PFOS神經(jīng)毒性作用機(jī)制。
1 對象與方法
1?1 試劑與儀器 全氟辛磺酸鉀鹽（瑞士fluka公司），用2%吐溫-80配制。鄰苯二甲醛、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸（美國Sigma公司）。醋酸鉀為分析純，甲醇為色譜純。高效液相色譜儀為HP HEWLETT PACKARD SERIES-1100（日本惠普公司）；C18色譜柱（150mm×4.6mm 5μm）（美國Phenomenex公司）。超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)JY96-ⅡN（寧波新芝生物科技股份有限公司）。
1?2 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理 健康成年Wistar大鼠（中國醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心）56只，體重190～220g，雌雄各半。隨機(jī)分為5組，1個對照組（2%吐溫-80溶液）和4個實(shí)驗(yàn)組PFOS染毒［25mg/(kg·bw)］，每組8只，經(jīng)口灌胃染毒1次。染毒2,4,8,24h后采集腦組織，經(jīng)2%戊巴比妥鈉麻醉后，按設(shè)定時間將大鼠頸靜脈放血處死，迅速斷頭，開顱取腦，在冰皿上分離腦組織,分別測定2,4,8和24h大鼠腦組織氨基酸含量。
1?3 樣品制備 將分離的腦組織用預(yù)冷的生理鹽水1∶9（w/v）勻漿5min，在冰水浴條件下超聲腦組織，3500r/min，4℃離心20min，取上清100μl用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。另取上清1ml 10000r/min，4℃高速離心20min后，取其上清，以備氨基酸測定。
1?4 考馬斯亮藍(lán)法測定腦組織蛋白質(zhì)含量 稱取10mg小牛血清蛋白，溶于蒸餾水中，分別稀釋配制成0.2，0.4，0.6，0.8，1mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品。分別取100μl待測樣品加入考馬斯亮藍(lán)5ml，722分光光度計(jì)比色，測定待測樣品中的蛋白質(zhì)含量以備標(biāo)定氨基酸。
1.5 鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生高效液相色譜熒光法檢測氨基酸含量 標(biāo)準(zhǔn)液配制：分別用1mol/L 氫氧化鈉溶液配制谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸及γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品1mmol/L的儲備液，臨時用1mol/L 氫氧化鈉稀釋配制成0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，100μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)系列。衍生試劑配制：稱取20mg鄰苯二甲醛，0.5ml β-巰基乙醇溶于0.5ml甲醇中；再加入9ml 0.4mol/L硼酸緩沖液(pH為10.5); 超聲溶解，新鮮配制，避光保存。衍生化反應(yīng)：在室溫下，吸取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液或樣品液100μl，1mol/L氫氧化鈉溶液100μl，加入鄰苯二甲醛衍生試劑400μl，混勻靜置2min后，進(jìn)樣30μl。
1?6 色譜條件 色譜柱：C18色譜柱（150mm×4.6mm 5μm），柱溫為28℃。流動相A：0.1mol/L醋酸鉀溶液，pH=5.89。流動相B：HPLC級甲醇。B相梯度洗脫條件：0～10min 10%→25%；12～19min 47%→60%；22～27min 100%→100%，28min 10%，平衡5min，30min結(jié)束洗脫。用安捷倫色譜工作站記錄并分析結(jié)果，峰面積用外標(biāo)法定量。熒光檢測器，激發(fā)波長250nm，發(fā)射波長410nm。
1?7 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行方差分析。
2 結(jié)果
2?1 行為觀察 PFOS染毒組大鼠在染毒2h后出現(xiàn)活動減緩，少動呆臥，嗜睡，24h后活動恢復(fù)正常。對照組未見異常改變。
2?2 色譜行為 在上述色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)液及大鼠腦組織中的谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸均得到良好分離。
2.3 不同PFOS急性染毒時間腦組織氨基酸含量變化比較（表1）
表1 PFOS暴露時間大鼠腦組織氨基酸含量的比較（略）
注：與對照組比較,* P<0.05
不同實(shí)驗(yàn)組的天冬氨酸含量無明顯變化；谷氨酸含量在2,4,8h組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；4h組含量降至最低后逐漸升高，24h已恢復(fù)正常。而抑制性氨基酸甘氨酸含量8,24h組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；γ-氨基丁酸24h組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
3 討論
天冬氨酸與谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其釋放增加可導(dǎo)致神經(jīng)興奮性或神經(jīng)毒性作用增強(qiáng)。γ-氨基丁酸、甘氨酸被認(rèn)為是重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性從而起到保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)建立的色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品中的4種氨基酸均得到良好分離。大鼠經(jīng)低劑量的PFOS染毒后，γ-氨基丁酸、甘氨酸的含量緩慢降低，同時天冬氨酸與谷氨酸含量先降低后恢復(fù)，使大鼠行為表現(xiàn)為嗜睡、行動遲緩，與報(bào)道有所不同〔4〕，可能是染毒劑量不同所致。腦組織中興奮性氨基酸總量的下降可能是與PFOS抑制興奮性氨基酸的合成以及降解增加有關(guān)。谷氨酸反應(yīng)迅速，持續(xù)時間短，恢復(fù)快，2h就開始降低，8h后逐漸升高，24h已恢復(fù)至正常水平。而γ-氨基丁酸、甘氨酸的作用緩慢，持續(xù)時間長可能是由于機(jī)體的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制作用所致，使PFOS對大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用在24h內(nèi)恢復(fù)。這種變化的具體機(jī)制以及神經(jīng)系統(tǒng)中重要的信使兼遞質(zhì)分子一氧化氮、氧自由基、神經(jīng)營養(yǎng)因子等是否參與PFOS的神經(jīng)毒性機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
【參考文獻(xiàn)】
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〔3〕 Giesy JP,Kannan K.Global distribution of perfluorooctane sulfonate in wildlife［J］.Environ Sci Technol,2001,35:1339-1342.
〔4〕 李瑩，金一和.全氟辛磺酸對大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)谷氨酸含量的影響［J］.衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，2004,18(20):232-234.
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