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益痛清對膜性腎病模型的治療及其機制研究
膜性腎病（MN，membranous nephropathy）是以致密物在腎小球毛細血管壁上皮下沉積為特征的原位免疫復(fù)合物腎炎。近年來大量實踐征明，對MN的治病有較好的療效，尤其在緩解蛋白尿方面。益腎清配方是以黃芪、小薊、川芎、海風(fēng)藤及車前子五種組成，具有補氣升陽、清熱化瘀、涼血止血、利水清濁的功能，可減輕或緩解MN的蛋白尿、保護腎功能、修復(fù)腎小球結(jié)構(gòu)的病理損傷。1
1.1 藥品和拭劑
益腎清，棕紅色粉末，1g粉末相當于13.75g生藥，北京制藥四廠提供。小牛血清白蛋白，帝道生物；大腸桿菌內(nèi)毒素，北京邦定；生化試劑盒，北京中生。
1.2 動物
雄性新西蘭家兔，1.5-2.0kg，中國藥品生物制品檢定所提供。BALB/C小鼠和C57BL/6J小鼠，18-22g，雌雄各半，雄性Wistar大鼠，150-200g均由北京大學(xué)區(qū)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供。
1.3 儀器
ZS-1A型半自動生化分析儀，北京中生；TJ-6離心機和LSl701液閃儀，Beckman；VIS-7220型可見分光光度計，北京瑞利。
2 方法
2.1 益腎情治療陽離子化牛血清白蛋白（C-BSA）誘導(dǎo)的家免MN。
2.1.1 模型制作
參考Boder1982年所用的方法制備C-BSA并制作模型。42只家兔測定各項血尿生化指標后，隨機選出8只作為正常組，其余動物全部制作模型。首先每只動物iv C-０BSAlmg及大腸桿菌內(nèi)毒素1μg，一周后開始每天iv C-BSA 10mg，4-7周時劑量加倍。待模型成功后除選兩只模型動物送病理檢查外，其余隨機分為模型組、益腎清10g、5g、2.5g生藥/kg體重劑量組．并給藥治療。
2.1.2 觀察項目
每周動物稱重一次。分別于實驗前、造模成功、藥物治療4周和8周時測定血尿生化指標。動物殺檢，作腎臟病理組織學(xué)檢查。
2.2 益腎清對正常小鼠免疫功能的影晌
2.2.1 非特異性免疫——碳粒廓清法
將40只BALB/C小鼠隨機分成益腎清28g、14g、7g生藥/kg體重劑量組和溶劑對照組（0.25%CMC溶液）。連續(xù)給藥20天后，小鼠iv印度墨汁0.05ml/10g體重，于1min和5min時分別取血20μl，加到2ml0.1%的碳酸鈉溶液中搖勻比色(680nm)測光密度。 計算廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α。
2.2.2 體液免疫——血清溶血素的分光光度測定法
將40只C57BL/6J小鼠分組給藥同非特異性免疫。連續(xù)給藥20天后，小鼠ip20%SRBC0.2，免疫后第4天取血，離心得血清，稀釋500倍作溶血反應(yīng)，比色（540nm）。計算樣品半數(shù)溶血值HC50。
2.2.3 細胞免疫——淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗（3H-TdR摻人法）
將40只C57BL/6J小鼠分組給藥同非特異性免疫。連續(xù)給藥20天后，制備小鼠脾細胞懸液，加入培養(yǎng)板，同時加入ConA或LPS，5%CO2培養(yǎng)72小時。終止培養(yǎng)前6小時，加人3H-TdR（終濃度為2μci/ml）。收集細胞，測定樣品放射強度。計算ConA和LPS誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化率。
2.3 益腎清對大鼠的利尿作用
將40只雄性健康Wistar大鼠食18h后，隨機分成益腎清20g、10g、5g生藥/kg體重劑量組和溶劑對照組（生理鹽水），給藥5ml/100g體重。給藥后半小時壓大鼠下腹部排盡余尿，分別放人代謝籠中，收集給藥后1、2、3、4、5小時的尿量。
2.4 益腎清對大鼠血液流流變學(xué)的影晌
將40只雄性健康WiStar大鼠隨機分成益腎清20g、10g生藥/體重劑量組、模型組（生理鹽水）和溶劑對照組（生理鹽水），給藥7天。最后一天除溶劑對照組外，其余四組動物sc Adr0.2ml，共2次，兩次間隔6h，間隔中間將功物放入冰水浴中5min給予冷刺激，造成血瘀模型。末次注射Adr18h后，腹主動脈取血，肝素抗凝，B轉(zhuǎn)子剪切速率由高到為307.20s-1、153.60s-1、61.44s-1、30.72s-1、15.36s-1，不同切變率下測全血表觀粘度（ηb）；分離血漿，307.20s-1下測血漿粘度（ηp）。
2.5 學(xué)處理組間比較用t。
3 結(jié)果
3.1 益腎清對C-BSA誘導(dǎo)的家兔MN的治療作用
3.1.1 一般情況
模型組動物于造模后不同程度的攝食減少、精神不振、體重減輕、水腫、少尿等現(xiàn)象。給藥后治療組動物水腫逐漸消失，模型組也有自愈趨勢。治療組動物體重高于模型組，但仍低于正常組，各組沒有顯著性差異。
3.1.2 血尿生化指標
造模第3周模型組有動物出現(xiàn)蛋白尿，至造模第7周所有模型組動物均出現(xiàn)蛋白尿，TP24、BUN、CHO比正常組顯著升高（P<0.01），ALB明顯降低(P<0.05)，TRIG也明顯升高(P<0.05)說明模型己經(jīng)形成。藥物治療4周時，僅益腎清10g生藥/kg體重劑量組的TP24比模型組明顯降低(P<0.05)，其余各組各指標均無明顯交化。治療8周時，治療組的TP24、BUN、TRIG及CHO均比模型組明顯降低（P<０.01或P<0.05），ALB明顯回升（P<0.05），基本恢復(fù)至正常水平。
3.1.3 腎臟病理組織學(xué)檢查
3.1.3.1 肉眼觀察
實驗結(jié)束時，動物殺檢，發(fā)現(xiàn)正常組的腎臟和脾臟外觀表面光滑，色澤正常。益腎清各治療組的外觀色澤及大小無明顯變化。而模型組的腎臟兩端鈍圓，中間略隆起，表面不甚光滑，個別腎及脾臟明顯增大，腎臟、脾臟的臟器系數(shù)均比正常組明顯增大(P<0.05)。
3.1.3.2 病理改變
正常組免疫熒光檢查陰性，光鏡和電鏡檢查未見異常。模型組IgG、C3沿腎小球毛細血管壁高強度顆粒狀沉積，C3沉積較弱。光鏡檢查可見GBM增厚，系膜增生并有少量粒細胞浸潤，電鏡檢查可見GBM彌漫增厚，上皮下多數(shù)電子致密物沉積，上皮細胞足突融合。益腎清各治療組的免疫熒光檢查與模型組相比無差異。10g、5g生藥/kg體重劑量組的光鏡和電鏡檢查已基本恢夏正常，2.5g生藥/體重劑量的的光鏡檢查已恢復(fù)正常，但電鏡檢查仍有GBM輕度增厚和節(jié)段性上皮細胞足突融合現(xiàn)象。
3.2 益腎清對正常小鼠免疫功能的影響
益腎清28g、14g生藥/kg體重劑量組，小鼠的α、HC50及ConA和LPS誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化的能力比溶劑對照組明顯增強（P＜0.05或P＜0.01）。各劑量組之間有明顯的量效關(guān)系。
3.3 益腎清對大鼠的利尿作用
益腎清20g、10g生藥/kg體重劑量組，大鼠1小時尿量及5小時內(nèi)總尿量與溶劑對照組相比都有顯著增加（P<0.01），提示其有較強的利尿作用。
3.4 益腎清對大鼠血液流變學(xué)的影響
血瘀模型組動物的μb值和μp值皆顯著高于溶劑對照相（P＜0.01），標志模型的形成；益腎清20g、10g生藥/kg體重劑量組，大鼠的ηb值和ηp值比模型組均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。說明益腎清能降低血瘀大鼠全血的高、低切變粘度及血漿粘度，提示其有活血化瘀的作用。
4 討論
自1982年以來，Boder等用C-BSA成功誘導(dǎo)了家兔MN之后，陽離子抗原已被廣泛地應(yīng)用于腎炎的實驗研究。該模型與人類MN頗為相似，具有一定的代表性。它發(fā)病率高，重復(fù)投好，病理改交一致，適合腎炎發(fā)病機理及防治的研究。
本實驗成功地復(fù)制了C-BSA誘導(dǎo)的家免MN模型。比較正常組，模型組動物TP24和BUN明顯升高，ALB顯著降低，TRIG和CHO也顯著增加，這些指標的變化與文獻報導(dǎo)一致。依據(jù)MN的病理改變可分四期。本突破的模型組IgG、C3沿腎小球毛細血管壁高強度顆粒狀沉積。光鏡檢查可見GBM增厚，系膜增生并有少量粒細胞浸潤，電鏡檢查可見GBM彌漫增厚，上皮下多數(shù)電子致密物沉積．上皮細胞足突融合。此癥狀與MNⅢ期病理癥狀相符，說明此實驗?zāi)Ｐ蛷?fù)制成功。
益腎清的主要成分有：黃芪、小薊、川芎、海風(fēng)藤及車前子。黃芪主補氣升陽，利水退腫。小薊主清熱解毒，涼血止血，清下焦熱結(jié)，可控制炎癥反應(yīng)。川芎與海風(fēng)藤協(xié)同作用，活血行氣，祛濕通絡(luò)，可改善毛細血管循環(huán)。車前子主利水，分清濁，可發(fā)揮疏通尿路作用。為了更深一步的研究，我們觀察了益腎清對大鼠的尿量、血液流變學(xué)及正常小鼠免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)該藥具有較強的增強免疫、利尿和活血化瘀功能。說明益腎清對MN的治療可能是通過利尿、活血化瘀或免疫增強作用等多種機制發(fā)揮作用的，但確切機制還需進一步驗證。
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