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殼聚糖的復(fù)合法降解及降解產(chǎn)物降血糖活性的研究
【摘要】 目的研究復(fù)合法降解殼聚糖及降解產(chǎn)物的生物活性方法在纖維素酶降解的后期引入H2O2氧化降解殼聚糖。觀察其降解產(chǎn)物對糖尿病小鼠生化指標的影響。結(jié)果最佳工藝條件為：纖維素酶降解時酶糖比0.2，pH 4.6、50℃、時間為3 h，后續(xù)H2O2降解時H2O2用量為0.8～1.0(ml/g)、75℃、時間為1.5 h，所得降解產(chǎn)物的平均分子量約為1 700。工藝所生產(chǎn)的低聚殼聚糖用量為 100 mg/kg時具有明顯的降血糖生物活性，其功效甚至優(yōu)于拜糖蘋。結(jié)論該復(fù)合降解工藝具有成本低，易于工業(yè)化，而且所得產(chǎn)品具有較高的生物活性。
【關(guān)鍵詞】 殼聚糖; 低聚殼聚糖; 降解; 血糖; 生物活性
殼聚糖作為天然堿性多糖，其資源量僅次于纖維素，分子量從幾十萬到幾百萬不等。降解后的低聚殼聚糖因溶解性增強，容易被吸收利用，尤其是分子量在1 500左右的產(chǎn)品顯示出獨特的生理活性和功能[1]。目前，由殼聚糖降解制備優(yōu)質(zhì)低聚殼聚糖的工業(yè)化生產(chǎn)成為該多糖廣泛推廣使用的瓶頸。在已有研究的眾多降解方法中，非專一性酶降解和H2O2氧化降解法比較有望實現(xiàn)大規(guī)�；a(chǎn)。其中H2O2氧化降解具有成本低、降解速度快、產(chǎn)品無殘毒等優(yōu)勢。但反應(yīng)在H2O2用量大、溫度高及反應(yīng)時間長的條件下易發(fā)生副反應(yīng)，制備產(chǎn)品的活性也受到質(zhì)疑。與其相比，酶降解由于無副反應(yīng)、降解條件溫和、降解過程容易控制、產(chǎn)品生物活性高而引起人們的廣泛關(guān)注[2]。在眾多非專一性酶的篩選過程中，纖維素酶因存在廣泛，生產(chǎn)成本低，對殼聚糖具有一定降解作用而受到重視，但纖維素酶活力有限，降解效率低，產(chǎn)物分子量分布較寬[3]。為此，本研究在纖維素酶降解的后期向體系內(nèi)引入H2O2快速氧化降解，以提高反應(yīng)速率、縮小產(chǎn)品分子量分布寬度。最后對制備的低聚殼聚糖產(chǎn)品進行降血糖生物活性研究，以評價該制備工藝的可行性。
一、 器材
1.1 材料殼聚糖，濟南海得貝海洋生物工程有限公司，脫乙酰度>90%;纖維素酶，天津麗華制劑廠，酶活力≥40 000 U·mg-1;H2O2，30%分析純。拜糖蘋，北京拜爾醫(yī)藥保健有限公司產(chǎn)品;四氧嘧啶，Sigma公司提供。
1.2 儀器20m3柔性反應(yīng)釜，德國進口;小型板框壓濾機，浙江省海寧市豐源過濾設(shè)備有限公司;DZF-6050型離心噴霧干燥器，常州市一步干燥設(shè)備廠;LC-10AD凝膠色譜儀，日本島津;血糖儀，上海榮盛生物技術(shù)有限公司提供。
1.3 動物3月齡雄性昆明小鼠，體質(zhì)量20 ～30 g，軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。
二、方法
2.1 降解實驗
2.1.1 纖維素酶的降解實驗在攪拌的情況下，將200 g殼聚糖按1∶50(W/V)混合，加入適量冰醋酸溶解后，快速升溫至所需溫度，加纖維素酶進行恒溫降解。達到預(yù)定時間后迅速升溫至100℃使酶失活，取樣稀釋過濾、用凝膠色譜分析產(chǎn)物的平均分子量[3]。實驗以酶糖比n、pH和溫度T為主要影響因素設(shè)計L9(34)正交實驗，得最佳組合工藝條件為n=0.1，pH=4.6，T=50℃。
2.1.2 H2O2氧化降解工藝條件的確定在纖維素酶降解的基礎(chǔ)上升溫至預(yù)定溫度，加入H2O2后繼續(xù)降解，到預(yù)定時間后取樣、過濾分析產(chǎn)物平均分子量。最后在確定的最佳復(fù)合降解工藝條件下對殼聚糖進行降解，卸料降溫，板框壓濾、噴霧干燥后待用。
2.2 降解物對糖尿病小鼠生化指標的影響
2.2.1 高血糖模型的復(fù)制及分組小鼠禁食12 h，四氧嘧啶生理鹽水溶液(2%)腹腔注射(一次性給藥)，劑量為180 mg/kg，72 h后空腹尾尖取血，血糖儀測血糖，大于11 mol/L的小鼠入選糖尿病模型。取10只正常小鼠為正常組。將造模成功的小鼠隨機分成5組，每組10只，分別為模型組，殼聚糖原料組(100 mg/kg)，低劑量降解產(chǎn)物組(100 mg/kg)，高劑量降解產(chǎn)物組(200 mg/kg)，拜糖蘋治療組(20 mg/kg)。灌胃1次/d，連續(xù)給藥28 d。正常組和模型組灌胃生理鹽水。
2.2.2 動物標本留取每天觀察各組小鼠的進食量、飲水及尿量;給藥14 d和28 d后尾尖取血，血糖儀測血糖;實驗結(jié)束后小鼠被斷椎處死，取肝、腎組織，用濾紙吸干表面血跡后稱重。
2.3 統(tǒng)計學分析用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，所得數(shù)據(jù)用 ±s表示，組間差異采用t檢驗。
三、結(jié)果
3.1 纖維素酶的降解過程研究為了考察纖維素酶的催化降解過程，在正交實驗確定的最佳組合條件下對殼聚糖進行降解，產(chǎn)物的平均分子量Mw隨時間的變化情況見圖1。
纖維素酶降解過程
圖1表明，在開始降解的0.75 h內(nèi)，產(chǎn)品平均分子量迅速下降。這也證實了纖維素酶對殼聚糖主要進行內(nèi)切降解反應(yīng)。隨著反應(yīng)的進行，殼聚糖聚合度減小，產(chǎn)物平均分子量下降趨勢變緩。這與產(chǎn)物濃度的增加在一定程度上抑制了降解反應(yīng)的進行有關(guān)。當降解達到3 h后，產(chǎn)物的平均分子量下降趨勢非常微弱，維持在2萬左右。因此，可在纖維素酶降解3 h后，引入H2O2進行降解。
3.2 H2O2氧化降解工藝條件的確定
3.2.1 溫度對降解過程的影響在纖維素酶降解的基礎(chǔ)上，不同溫度條件下H2O2氧化降解殼聚糖過程見圖2。
溫度對H2O2降解過程的影響 圖2表明，引入H2O2后產(chǎn)物平均分子量迅速下降，降解速率基本上與溫度呈正比。這可能是殼聚糖分子內(nèi)部尚存在少量易斷裂 “弱鍵”，如：少數(shù)鏈節(jié)上具有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)、存在少數(shù)戊糖的環(huán)狀結(jié)構(gòu)、或存在少數(shù)開環(huán)的半縮醛鏈節(jié)結(jié)構(gòu)。之后產(chǎn)物平均分子量下降比較平緩，且溫度越高進入平緩階段越早。此外，在反應(yīng)過程中還發(fā)現(xiàn)，在高于80℃條件下降解時，所得產(chǎn)物顏色隨著降解時間的延長由淡黃色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚�，且溫度越高變化越明顯。分析認為當殼聚糖降解到一定程度后，其空間結(jié)構(gòu)由卷曲狀轉(zhuǎn)變成短的直鏈狀，氨基基團活躍性增強，易發(fā)生羰氨副反應(yīng)。為了有效控制副反應(yīng)消耗具有生物活性的氨基，確定后期H2O2氧化反應(yīng)溫度為75℃、時間為1.5 h。
3.2.2 H2O2用量對降解過程的影響在纖維素酶降解的基礎(chǔ)上，質(zhì)量質(zhì)量分數(shù)為30%H2O2的用量與殼聚糖用量的比值n對降解過程的影響見圖3。
H2O2用量對降解過程的影響
由圖3可以看出，在反應(yīng)時間和溫度相同的條件下，降解產(chǎn)物的平均分子量隨H2O2用量的增加而下降。當用量比增加到0.8以后，下降趨勢明顯變緩。由此確定后續(xù)H2O2的最適用量比值為0.8～1.0(ml/g)。此時，可獲得平均分子量約為1 700左右的降解產(chǎn)物。
采用纖維素酶與雙氧水復(fù)合降解殼聚糖與直接采用雙氧水降解相比，雙氧水降解時間縮短將近50%，產(chǎn)品平均分子量低且顏色較淺[4]。分析認為，殼聚糖溶液經(jīng)過纖維素酶初步降解后分子量有了很大降低，呈均相溶液，從而抑制了雙氧水可能對部分殼聚糖過度降解。此外，降解時間縮短也很好地限制了副反應(yīng)的發(fā)生。
3.3 降解產(chǎn)物的降血糖活性研究
3.3.1 一般情況的觀察實驗過程中各組小鼠體重、血糖及內(nèi)臟重量的變化見表1。表1 小鼠體重、血糖及內(nèi)臟重量的變化與正常組對照，1P<0.01，2P<0.05;與模型組對照，3P<0.01，4P<0.05
經(jīng)四氧嘧啶注射造模成功后的糖尿病小鼠，出現(xiàn)飲食量增加、多飲多尿、體毛松散及精神萎靡等癥狀。未經(jīng)治療的模型組“三多”癥狀尤其突出，體重也明顯低于正常組(P<0.05)。低劑量降解產(chǎn)物和拜糖蘋治療組的一般癥狀得到明顯改善，體重與正常組無顯著差異。殼聚糖原料和高劑量降解產(chǎn)物治療組的癥狀改善居中。
3.3.2 降解產(chǎn)物對糖尿病小鼠血糖的影響與模型組相比，殼聚糖原料治療組血糖值雖然有所降低，但并不存在顯著性差異。原因為殼聚糖本身分子量過大，不能被有效吸收所致。而高、低劑量降解產(chǎn)物和拜糖蘋治療組的14，28 d血糖值明顯低于模型組(P<0.01)。其中，低劑量降解產(chǎn)物的降血糖效果甚至優(yōu)于拜糖蘋。由此說明殼聚糖原料經(jīng)過本工藝降解后具有明顯的降血糖生物活性，且起效較快。與正常組相比，單獨使用降解產(chǎn)物并不能使血糖降到正常值。
3.3.3 降解產(chǎn)物對糖尿病小鼠內(nèi)臟的影響由表1中的數(shù)據(jù)分析可知，除拜糖蘋治療組外(P<0.05)，其它治療組的肝臟指數(shù)雖然高于模型組，但不存在顯著性差異。這說明殼聚糖及降解產(chǎn)物對肝臟具有一定保護功能，但效果不顯著。同時也證實了臨床上廣泛使用的拜糖蘋降糖藥具有對肝臟損害小的優(yōu)點。對于腎臟，低劑量降解產(chǎn)物治療組的指數(shù)與正常組較接近，而其它治療組的肝臟指數(shù)與模型組接近，明顯高于正常組(P<0.01)。可見，使用一定劑量本工藝生產(chǎn)的低聚殼聚糖對糖尿病小鼠進行治療時，可同時達到保護肝、腎的功效。有關(guān)低聚殼聚糖降糖作用機制目前尚不清楚。大多推測為，殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中的大量氨基調(diào)節(jié)機體內(nèi)pH呈弱酸性，從而增強胰島素的活性。也有人認為降解后的低聚殼聚糖對動物機體內(nèi)α-葡萄糖苷酶具有一定抑制作用，阻礙了它從碳水化合物和有關(guān)多糖的非還原端切下葡萄糖[5]。根據(jù)本研究結(jié)果，降解產(chǎn)物的治療效果與拜糖蘋比較接近，而拜糖蘋正是α-葡萄糖苷酶的抑制劑，因此，偏向于后者。
四、 結(jié)論
本研究提出了一種纖維素酶結(jié)合雙氧水降解殼聚糖的復(fù)合降解方法。實驗確定最佳工藝條件為：纖維素酶降解時酶糖比為0.2、pH4.6、反應(yīng)溫度為 50℃、時間為3 h，后續(xù)H2O2降解時30% H2O2用量與殼聚糖原料的比值為0.8∶1.0(ml/g)、75℃、時間為1.5 h，所得降解產(chǎn)物的分子量約為1 700。降解產(chǎn)物對糖尿病小鼠降血糖研究表明，用量100 mg/kg時具有明顯的降血糖生物活性，且起效較快。其功效甚至優(yōu)于拜糖蘋。此外，對糖尿病小鼠進行治療時，可同時起到保護肝、腎的功效。
因此，該降解工藝不僅有效結(jié)合了非專一性酶和雙氧水氧化降解的優(yōu)勢，具有成本低，易于工業(yè)化，所得產(chǎn)品具有較高的生物活性。
【參考文獻】
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[2] 林 強，馬可力.纖維素酶-過氧化氫降解法制備低聚殼聚糖的研究[J].海洋科學，2003,27(6):7.
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[5] 魏 濤，唐粉芳，高兆蘭.殼聚糖降血脂、降血糖及增強免疫力作用的研究[J].食品科學，2000,21(1):48.
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