反義核酸技術(shù)及其在寄生蟲(chóng)學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展

反義核酸技術(shù)及其在寄生蟲(chóng)學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展 反義核酸是指能與特定mRNA精確互補(bǔ)、特異阻斷其翻譯的RNA或DNA分子。利用反義核酸特異地封閉某些基因表達(dá)，使之低表達(dá)或不表達(dá)，這種技術(shù)即為反義核酸技術(shù)。它包括反義RNA、反義DNA和核酶(ribozymes)三大技術(shù)。反義核酶作為一種基因下向調(diào)節(jié)作用因子，在抑制一些有害基因的表達(dá)和失控基因的過(guò)度表達(dá)上發(fā)揮著重要作用。隨著反義核酶技術(shù)的發(fā)展和成熟，已逐漸應(yīng)用于抗某些人體寄生蟲(chóng)病的研究。本文擬就反義核酸技術(shù)的作用原理和特點(diǎn)作一簡(jiǎn)要概述，著重闡述其在寄生蟲(chóng)領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)展。

　　1　反義核酸的作用原理

　　反義核酸目前有三種來(lái)源：一是利用固相亞磷酰胺法人工合成的短小反義寡聚核苷酸(antisense oligodeoxyncleotides，AON)，這是反義核酸最普遍的應(yīng)用方式，包括未修飾AON和硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化等修飾AON二類(lèi)，其中以PSAON應(yīng)用最廣泛。ANO設(shè)計(jì)合成簡(jiǎn)單，只要其順序與靶mRNA部分順序互補(bǔ)即可，而對(duì)基因的讀碼框無(wú)要求；二是更具有實(shí)用價(jià)值的工人表達(dá)載體，包括單個(gè)基因和多個(gè)基因的聯(lián)合反義表達(dá)載體，它是利用基因重組技術(shù)將靶基因序列反向持插入到載體的啟動(dòng)子和終止子之間，通過(guò)轉(zhuǎn)錄可源源不斷產(chǎn)生反義RNA分子；三是天然存在的反義核酸分子，但目前分離純化尚存在困難。

　　1.1　反義RNA和反義DNA

　　反義RNA是指能和mRNA完全互補(bǔ)的一段小分子RNA或寡聚核苷酸片段，反義DNA是指能與基因DNA雙鏈中的有義鏈互補(bǔ)結(jié)合的短小DNA分子。反義RNA和反義DNA主要是通過(guò)mRNA的翻譯和基因DNA的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用：1)抑制翻譯。反義核酸一方面通過(guò)與靶mRNA結(jié)合形成空間位阻效應(yīng)，阻止核糖體與mRNA結(jié)合，另一方面其與mRNA結(jié)合后激活內(nèi)源性RNase或ribozyme，降解mRNA；2)抑制轉(zhuǎn)錄。反義DNA與基因DNA雙螺旋的調(diào)控區(qū)特異結(jié)合形成DNA三聚體(triplex),或與DNA編碼區(qū)結(jié)合，終止正在轉(zhuǎn)錄的mRNA鏈延長(zhǎng)。此外，反義核酸還可抑制轉(zhuǎn)錄后mRNA的加工修飾，如5'端加帽、3'端加尾(poly a)、中間剪接和內(nèi)部堿基甲基化等，并阻止成熟mRNA由細(xì)胞核向細(xì)胞漿內(nèi)運(yùn)輸。

　　1.2　核酶

　　Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲(chóng)核糖體RNA前體在成熟過(guò)程中，可精確地自我切除某些片段并重新連接，這種具有酶催化活性的RNA稱(chēng)之為核酶。

　　核酶廣泛存在于生物細(xì)胞中，有錘頭狀和發(fā)夾二種結(jié)構(gòu)。酶活性中心由兩個(gè)臂和中間的功能區(qū)組成。兩個(gè)臂序列高度保守，與靶RNA特異互補(bǔ)結(jié)合，相當(dāng)于一種反義RNA，而功能區(qū)則可通過(guò)降解RNA的磷酸二酯鍵而分解消化靶RNA，而核酶本身在作用過(guò)程中并不消耗。核酶裂解分子依賴(lài)嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)形成，裂解部位總是位于靶RNA分子中GUX三聯(lián)體(X：C、U、A)下游方向即3'端。

　　核酶除天然存在外，也可人工合成。根據(jù)核酶的作用位點(diǎn)、靶mRNA周?chē)�的序列和核酶本身高度保守序列，可方便地人工設(shè)計(jì)合成核酶的特異性序列。此外，利用基因工程將核酶的編碼基因克隆在SP6或T7等啟動(dòng)子下游，通過(guò)轉(zhuǎn)錄合所需核酶。核酶能特異切割RNAA分子，使阻斷基因表達(dá)，特別是阻斷有害基因的表達(dá)成為可能。如果已知靶mRNA中GUX三聯(lián)體的位置，可將核酶的編碼基因插入反義表達(dá)載體的適當(dāng)位置，這樣轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的含有核酶的反義RNA具有雙重功能：一方面具有反義抑制作用，另一方面具有切割靶mRNA的催化作用。核酶在抗腫瘤、抗病毒方面具有十分誘人的前景，第一個(gè)應(yīng)用核酶進(jìn)行艾滋病基因治療的臨床計(jì)劃已獲準(zhǔn)，核酶作為一種遺傳信息藥物，在腫瘤基因治療中必將日益受到重視。

　　2　反義核酸的作用特點(diǎn)

　　反義核酸作為基因治療藥物之一，與傳統(tǒng)藥物相比具有諸多優(yōu)點(diǎn)。1)高度特異性：反義核酸藥物通過(guò)特異的堿基互補(bǔ)配對(duì)作用于靶RNA或DNA，猶如“生物導(dǎo)彈”。2)高生物活性、豐富的信息量；反義核酸是一種攜帶特定遺傳信息的信息體，堿基排列順序可千變?nèi)f化，不可窮盡。3)高效性：直接阻止疾病基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。4)最優(yōu)化的藥物設(shè)計(jì)：反義核酸技術(shù)從本質(zhì)上是應(yīng)用基因的天然順序信息，實(shí)際上是最合理的藥物設(shè)計(jì)。5)低毒、安全：反義核酸尚未發(fā)現(xiàn)其有顯著毒性，盡管其在生物體內(nèi)的存留時(shí)間有長(zhǎng)有短，但最終都將被降解消除，這避免了如轉(zhuǎn)基因療法中外源基因整合到宿主染色體上的危險(xiǎn)性。

　　3　反義核酸技術(shù)在寄生蟲(chóng)學(xué)中的應(yīng)用

　　反義核酸技術(shù)的飛速發(fā)展和成熟，使其逐漸滲透并應(yīng)用到寄生蟲(chóng)學(xué)領(lǐng)域，豐富和發(fā)展了寄生蟲(chóng)病的基因治療策略。反義核酸技術(shù)在抗寄生蟲(chóng)病研究的應(yīng)用主要集中于原蟲(chóng)類(lèi)，如瘧原蟲(chóng)、錐蟲(chóng)和利什曼原蟲(chóng)等，而且反義核酸中又以AON方面的報(bào)道最多。下面著重就AON在寄生蟲(chóng)方面的研究應(yīng)用作用一簡(jiǎn)要闡述。

　　3.1　瘧原蟲(chóng)

　　瘧原蟲(chóng)嘌呤核苷酸合成具有特殊性，即無(wú)從頭合成途徑，依靠補(bǔ)救合成途徑利用體內(nèi)游離的嘌呤或嘌呤核苷。瘧原蟲(chóng)的二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)和胸苷酸合酶(thymidylate synthase，TS)結(jié)合形成雙功能蛋白(DHFR-TS)，這對(duì)于維持瘧原蟲(chóng)四氫葉酸水平和DNA合成極為重要，此酶也是瘧原蟲(chóng)脫氧胸苷酸生物合成唯一通路中必不可少的酶�？汞懰幹械目谷~酸代謝藥如乙胺嘧啶，就是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制DHFR-TS來(lái)阻斷蟲(chóng)體脫氧胸苷酸生物合成。然而，隨著惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodium falciparum)多藥抗性株的出現(xiàn)和廣為傳播，瘧疾的化療面臨重大挑戰(zhàn)，促使人們尋求新的抗瘧療法。目前，DHFR-TS是AON抗瘧作用首選靶基因。

　　生物大分子進(jìn)入感染紅細(xì)胞中的瘧原蟲(chóng)，必需穿透三層膜，即紅細(xì)胞膜、納蟲(chóng)泡膜和蟲(chóng)體的胞質(zhì)膜。研究表明，不能穿透紅細(xì)胞膜和納蟲(chóng)泡膜的大分子和葡聚糖、IgG2a抗體和蛋白A等，可經(jīng)過(guò)納蟲(chóng)微管(parasitophorous duct)進(jìn)入蟲(chóng)體，蟲(chóng)體通過(guò)胞吞作用直接從細(xì)胞外攝入大分子物質(zhì)。因此，對(duì)于小分子的AON而言，作用于感染紅細(xì)胞中的蟲(chóng)體完全成為可能，下述眾多研究已充分證明了這一點(diǎn)。Rapaport等(1992)研究發(fā)現(xiàn)，以DHFR-TS為靶21 nt PS AON能選擇性地進(jìn)入惡性瘧原蟲(chóng)感染紅細(xì)胞，對(duì)體外培養(yǎng)的氯喹敏感株和耐藥株蟲(chóng)體具有同等的抑制效果，而未感染瘧原蟲(chóng)的紅細(xì)胞則完全為不攝入AON，因此這對(duì)應(yīng)用反義核酸于抗瘧治療非常有利。

　　諸多研究表明，AON越長(zhǎng)，對(duì)轉(zhuǎn)譯的抑制作用就越強(qiáng)；AON濃度越高，非特異性抑制作用越明顯，在低濃度時(shí)則呈特異性抑制。Sartorius和Franklin(1991)以DHFR-TS的mRNA為靶合成系列AON，利用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，探討AON對(duì)體外轉(zhuǎn)譯的抑制作用。在DHFR翻譯起始位點(diǎn)處合成了6條21－49nt不等長(zhǎng)的AON，在TS編碼區(qū)全成的30nt、39nt和49nt三條AON。當(dāng)AON長(zhǎng)度為30nt或更長(zhǎng)時(shí)，呈明顯轉(zhuǎn)譯抑制作用，抑制率可高達(dá)50％以上。其中，TS編碼區(qū)的49nt aON(OTS49)抑制效果最高，當(dāng)濃度在45μmlo/L時(shí)的抑制率幾乎達(dá)90％，主要是因?yàn)镺TS49與DHFR-TS靶mRNA結(jié)合抑制TS合成，這從翻譯產(chǎn)物的分子量(55 kDa)要比天然DHFR-TS(71 kDa)小且無(wú)TS活性可看出。

　　Ramasamy等和Clark等研究表明，在較高濃度下，無(wú)論DHFR-TS正義還是反義的寡聚核苷酸(M1K，M2K)，均能抑制裂殖子入侵紅細(xì)胞。究其原因，可能與高濃度的AON帶有較多的負(fù)電荷有關(guān)。Kanagaratnam等(1998)分析了瘧原蟲(chóng)裂殖子表面蛋白基因的反義和正義寡聚核苷酸對(duì)瘧原蟲(chóng)體外生長(zhǎng)的影響，無(wú)論AON單獨(dú)使用抑或與脂質(zhì)體混合使用，均未觀察到特異抑制效應(yīng)。但在相同濃度范圍內(nèi)，反義和正義寡核苷酸以及具有多聚陰離子的硫酸葡聚糖，均可抑制裂殖子入侵紅細(xì)胞。當(dāng)寡聚核苷與陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合后負(fù)電荷被中和時(shí)，則對(duì)裂殖子入侵紅細(xì)胞的抑制作用被取消。由此推測(cè)，寡聚核苷酸有可能借助其多聚陰離子特性干擾裂殖子與細(xì)胞上受體結(jié)合，多聚陰離子可能對(duì)瘧疾病治療有幫助。

　　3.1.2　AON不同修飾物對(duì)抗瘧作用影響

　　最近，Barker等以DHFR-TS基因?yàn)榘�，比較了硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化修飾AON，以及不同空間結(jié)構(gòu)AON對(duì)體外培養(yǎng)蟲(chóng)體生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果顯示，5'和3'端至少含有3個(gè)PS基因的PO-PS雜合體AON、全部為PS修飾的AON，與部分PS修飾的AON抑制作用相同。在低濃度下(1μmol/L)，PO-PS aON和PS AON比PS-甲基化AON抑制率高25％。此外，通過(guò)延長(zhǎng)AON序列增加干-環(huán)結(jié)構(gòu)形成，提高AON的自我穩(wěn)定性，結(jié)果獲得2個(gè)有干-環(huán)結(jié)構(gòu)的AON(RB39、RB41)，其抑蟲(chóng)生長(zhǎng)率比序列未延長(zhǎng)的AON約要高20％。

　　3.1.3　AON不同靶基因?qū)�抗瘧作用影�?/P>

　　AON對(duì)不同基因的抑制作用不一致，這和該基因在蟲(chóng)體代謝過(guò)程中是否起舉足輕重作用密切相關(guān)。AON的抗瘧研究主要集中在DHFR-TS基因，這固然與其在瘧原蟲(chóng)核苷酸代謝中的特殊地位有關(guān)(見(jiàn)前述)。Barker等(1996)對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)耐藥株多個(gè)靶基因的AON作用進(jìn)行了比較研究，方法是將PS aON加入到瘧原蟲(chóng)體外培養(yǎng)液中，培養(yǎng)48小時(shí)后，通過(guò)鏡檢和3氚-次黃嘌呤摻入試驗(yàn)觀察AON對(duì)蟲(chóng)體的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果表明，抑制作用與AON濃度密切相關(guān)。當(dāng)AON濃度為1μmol/L時(shí)，AON呈非特異性抑制；當(dāng)濃度在0.5－0.005μmol/L范圍時(shí)，以DHFR-TS、二氫喋呤合成酶、核苷酸還原酶、裂殖體多基因家族和紅細(xì)胞結(jié)合抗原-175為靶的PS aON與對(duì)照組相比，均能特異地顯著抑制蟲(chóng)體生長(zhǎng)(P＜0.0001)，而DNA聚合酶α的PS aON抑制作用更弱，磷酸丙糖異構(gòu)酶的PS AON抑制作用則與對(duì)照組相同。

　　瘧原蟲(chóng)感染紅細(xì)胞中，近75％血紅蛋白被滋養(yǎng)體降解而形成大量對(duì)蟲(chóng)體有害的血紅素，必須在消化泡中聚集成對(duì)蟲(chóng)體無(wú)毒的瘧色素。研究表明，惡性瘧原蟲(chóng)組氨酸富集蛋白(HRP)家族中，HRPⅡ和HRPⅢ有明顯的促進(jìn)瘧色素形成功能。因此，如能特異阻斷這些基因表達(dá)，抑制瘧色素的形成，有可能使之成為一種抗瘧新途徑。HRPⅡ與HRPⅢ從同一祖先基因分化而來(lái)，二者高度同源，翻譯起始位點(diǎn)附核苷酸序列則完全相同。

　　3.2　錐蟲(chóng)

　　屬于動(dòng)基體目的布氏錐蟲(chóng)(Trypanosoma burcei)通過(guò)抗原不斷變異逃避宿主的免疫力，抗原變異是由于不同的變異體專(zhuān)一表面糖蛋白(variant-specific surface glycoprotein，VSG)基因呈間斷表達(dá)所致，VSG基因表達(dá)產(chǎn)物在錐蟲(chóng)表面形成外膜，覆蓋蟲(chóng)體。研究表明，VSG mRNA可分為二部分：一部分是各種變異體特有的主外顯子序列，占主要部分；另一部分是共同的5'端小外顯子序列，通常為35個(gè)核苷酸長(zhǎng)，幾乎所有的VSG mRNA均含有此序列。實(shí)際上，除VSG外，錐蟲(chóng)的鈣調(diào)蛋白、微管蛋白和磷酸丙糖異構(gòu)酶mRNA中也存在共同的5'端小外顯子序列，這似乎是動(dòng)基體目寄生原蟲(chóng)編碼基因的共同結(jié)構(gòu)特征。由于宿主mRNA無(wú)這種小外顯子序列，以小外顯子序列為靶的AON就很容易實(shí)現(xiàn)抑制眾多基因表達(dá)的效果，使反義核酸抗錐蟲(chóng)感染成為可能。

　　Cornelissen等應(yīng)用麥胚提取物轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)、35S-甲硫氨酸摻入試驗(yàn)和蛋白質(zhì)SDS-PAGE方法，對(duì)與錐蟲(chóng)小外顯子序列不同位點(diǎn)互補(bǔ)和不同長(zhǎng)度的AON體外轉(zhuǎn)譯抑制作用進(jìn)行了比較分析。結(jié)果所有AON均能抑制轉(zhuǎn)錄，且抑制程度與AON長(zhǎng)度和濃度有關(guān)，AON越長(zhǎng)，濃度越高則抑制作用越強(qiáng)。如3個(gè)12nt和AON抑制率達(dá)35％－60％，而22nt和34nt aON在濃度為15－30μmol/L時(shí)對(duì)錐蟲(chóng)總RNA轉(zhuǎn)錄抑制率高達(dá)95％－100％。在同一轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)中，BMV病毒(Brome mosaic Virus)和無(wú)小外顯子序列的錐蟲(chóng)磷酸甘油酸激酶mRNA卻完全不受34 nt AON的抑制，與錐蟲(chóng)小外顯子序列不互補(bǔ)的18 nt AON對(duì)錐蟲(chóng)轉(zhuǎn)譯則無(wú)任何影響。上述發(fā)現(xiàn)充分證明，以錐蟲(chóng)5'端小外顯子mRNA序列為靶的AON對(duì)轉(zhuǎn)譯具有特異抑制作用。

　　Walder等用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)，也獲得上述相類(lèi)似的結(jié)果。Verspieren等研究表明，小外顯子AON的二級(jí)結(jié)構(gòu)和堿基的修飾會(huì)直接影響其與靶mRNA的親和性，從而間接影響AON的轉(zhuǎn)譯抑制效果。如上述與小外顯子第2位至第13位堿基互補(bǔ)的12nt aON，雖然抑制布氏錐蟲(chóng)轉(zhuǎn)譯，但不能抑制活動(dòng)錐蟲(chóng)(Trypanosoma vivax)mRNA轉(zhuǎn)譯，這顯然與二種蟲(chóng)體的小外顯子第3位和第7位堿基不同有關(guān)。

　　Verspieren等首次嘗試用吖啶衍生物(acridine derivative)修飾布氏錐蟲(chóng)5'端小外顯子序列的AON，觀察其對(duì)培養(yǎng)蟲(chóng)體的殺傷作用。結(jié)果表明，連接有吖啶分子的9nt aON與相同長(zhǎng)度但未連接吖啶分子的AON相比，能更為有效地抑制錐蟲(chóng)蛋白質(zhì)的體外合成，且能有效地殺死體外培養(yǎng)蟲(chóng)體。無(wú)論如何，未連接吖啶的9nt aON和雖連接吖啶但不與錐蟲(chóng)5'端小外顯子序列互補(bǔ)的9nt AON，均不能殺死培養(yǎng)蟲(chóng)體。AON經(jīng)吖啶修飾后能提高其殺錐蟲(chóng)作用，推測(cè)可能與下述因素有關(guān)：一是通過(guò)吖啶修飾增加AON與靶mRNA間的親和力，二是提高對(duì)3'端核酸外切酶的抗性，延長(zhǎng)其作用半衰期，三是促進(jìn)AON對(duì)活細(xì)胞膜的穿透。因此，對(duì)AON進(jìn)行吖啶修飾提高其作用效率值得研究借鑒。

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