干細胞的研究進展

干細胞的研究進展 【摘要】 干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞群體。近年來干細胞的應(yīng)用幾乎涉及到所有生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本文概述了干細胞的生物學(xué)特性，并綜述了干細胞的可塑性、分離培養(yǎng)及其在基礎(chǔ)研究及臨床上的應(yīng)用的研究進展。最后，展望了今后研究的方向。

　　【關(guān)鍵詞】 干細胞；生物學(xué)特性；可塑性；分離培養(yǎng)；應(yīng)用

　　Advances in study of stem cells

　　【Abstract】 Stem cells are non-specialized cells which have the ability of self-renewal and multiple differentiation potential. The application of stem cells has nearly involved in all the research field on life sciences and biomedicine in recent years. This article summarizes the biological characteristic of stem cells, and reviews the latest progress in the study on stem cell’s plasticity, isolation, culture in vitro, and its extensive application in basic research and clinical application. The prospects of stem cells are also discussed.

　　【Key words】 stem cells; biological characteristic; plasticity; isolation; culture in vitro; application

干細胞（stem cells）是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體，即這些細胞可以通過細胞分裂維持自身細胞群的大小，同時又可以進一步分化成為各種不同的組織細胞，從而醫(yī)學(xué)界稱之為“萬用細胞”。1981年英國的Evans和Kaufman用延緩著床的胚泡首次成功地分離了小鼠胚胎干細胞,從而在全球掀起了有關(guān)干細胞的研究熱潮。1997年2月英國蘇格蘭羅斯林研究所威爾穆特博士等成功克隆出“多利”綿羊，1998年11月,美國Thomson［1］和Gearhart［2］分別用不同的方法獲得人胚胎干細胞及胚胎生殖細胞,此后,干細胞的研究便進入了一個全新的時代。1999年，有關(guān)干細胞的研究被Science評為1999年度十大科學(xué)進展之首。2000年12月干細胞研究再次被《科學(xué)》雜志評為該年度世界十大科學(xué)成就之一。本文就近幾年來干細胞的研究進展綜述如下。

　　1 干細胞的生物學(xué)特性

　　根據(jù)干細胞的發(fā)育階段，可將其分為胚胎干細胞（Embryonic Stem Cell,ES）和成體干細胞（Adult Stem Cell，AS）。胚胎干細胞即具有分化為機體任何一種組織器官潛能的細胞,包括胚胎干細胞、胚胎生殖細胞（Embryonic Germ Cell，EG）。成體干細胞即具有自我更新能力,但通常只能分化為相應(yīng)組織器官組成的“專業(yè)”細胞,它是存在于成熟個體各種組織器官中的干細胞,包括神經(jīng)干細胞（Neural Stem Ce11，NSC）、血液干細胞（Hematopoietic Stem Cell，HSC）、骨髓間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）、表皮干細胞（EPidexmis Stem Cell）、肝干細胞（Hepatic Stem Cell）等。

　　1.1 胚胎干細胞的生物學(xué)特性 　 胚胎干細胞最早是直接從小鼠早期胚胎分離建系的,它們具有其自身的生物學(xué)特性。與其他細胞系相比較, 胚胎干細胞的特點在于:（1）具有不斷增殖分化的能力，所以，在體外培養(yǎng)條件下可以建立穩(wěn)定的干細胞系，并保持高度未分化狀態(tài)和發(fā)育潛能性。1999年Soiter等［3］利用這個特性將ES/EBs及其分化細胞作為有關(guān)藥物的針對篩選系統(tǒng),進行藥物毒性檢測實驗。（2）具有高度的發(fā)育潛能和分化潛能。體內(nèi)外可分化出外、中、內(nèi)三個胚層的分化細胞，可以誘導(dǎo)分化為成體細胞內(nèi)各種類型的組織細胞。胚胎干細胞含有正常二倍染色體，具有種系傳遞功能,能廣泛參與宿主胚胎各組織器官的生長發(fā)育,并形成包括生殖系在內(nèi)的合體后代生殖細胞。1995年P(guān)acacio等［4］利用骨髓基質(zhì)細胞或其培養(yǎng)液,將胚胎干細胞在體外誘導(dǎo)分化為造血干細胞。1997年Baker等［5］在缺乏新霉素(geneticin,g418)的條件下,將Rosaβ-geo基因轉(zhuǎn)染胚胎干細胞后能在體外誘導(dǎo)分化為軟骨細胞。同年Deni等報告將胚胎干細胞通過懸滴培養(yǎng)可分化出脂肪細胞。（3）能進行體外培養(yǎng)擴增,還可以對其進行遺傳操作選擇, 如導(dǎo)入異源基因、報告基因或標(biāo)志基因，誘導(dǎo)某個基因突變等。擴增、遺傳操作及凍存均不喪失其多能性。凍存的細胞可在需要時隨時解凍,繼續(xù)培養(yǎng)不失其原有特性。

　　1.2 成體干細胞的生物學(xué)特征 　　干細胞在分化為特化細胞之前常產(chǎn)生一種或幾種祖細胞，然后由祖細胞分化產(chǎn)生特化細胞。與胚胎干細胞相比較，成體干細胞有以下幾個特點：(1)成體干細胞體積小，細胞器稀少，RNA含量較低，在增殖過程中處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，在組織結(jié)構(gòu)中位置相對固定。(2)成體干細胞數(shù)量很少，其基本功能是參與組織更新，創(chuàng)傷修復(fù)及維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。研究結(jié)果表明，即使在含量豐富的骨髓中，每10，000～15，000個骨髓細胞中只有一個造血干細胞［6］，人和動物皮膚中的干細胞含量僅為7%～8％［7］。Reynolds等［8］實驗證明成體哺乳動物腦內(nèi)的神經(jīng)干細胞數(shù)量極少，僅占室下帶區(qū)中相對靜止細胞數(shù)的0.1%～1%。(3)成體干細胞常處于一個有干細胞細胞基質(zhì)，對干細胞的增殖和分化起調(diào)控作用的各種信號分子的特定微環(huán)境或稱生物位（nich）中，干細胞是自我復(fù)制還是分化為功能細胞取決于所在的微環(huán)境和自身的功能狀態(tài)。(4)成體干細胞沒有確定的來源。有科學(xué)家推測，成體干細胞是胚胎發(fā)育過程中保存下來的未分化的細胞［6］，這揭示成體干細胞與胚胎干細胞可能會有更多的相似性與同源性。

　　2 干細胞的可塑性

干細胞的可塑性主要是指成體干細胞的可塑性。人們把成體干細胞具有分化為其他類型組織細胞的能力的這種現(xiàn)象稱為干細胞的可塑性（plasticity）［9］，橫向分化（transdifferentiation）［10］或轉(zhuǎn)決定（transdetermination）［11］。

　　1995年，Pereira等［12］證明，小鼠骨髓細胞在體外培養(yǎng)后具有向骨、軟骨和肺基質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力。1999年,Bjornson等［13］將胚胎和成年小鼠神經(jīng)干細胞,以及在體外克隆的神經(jīng)干細胞移植給亞致死劑量照射的小鼠,結(jié)果證明神經(jīng)干細胞可轉(zhuǎn)化為造血細胞。同年Jackson等［14］用 Hoechst333422-lowSP純化的小鼠造血干細胞進一步證明它可遷移到肌肉損傷部位,在參與肌肉再生的同時也參與血管的再生。2002年Vescovi 等［15］報道神經(jīng)干細胞除有向神經(jīng)元、星形細胞與少突膠質(zhì)細胞分化能力以外,還可分化為造血細胞譜系。
　　
　　肝干細胞也是干細胞可塑性的主要可靠證據(jù)之一。2000年Alison等［16］和Lagasse等［17］分別報道HSC可在體內(nèi)分化成肝細胞。2001年Shen等［18］在骨髓移植的試驗中發(fā)現(xiàn),肝臟干細胞能表達供體造血細胞的遺傳標(biāo)志。
　　
　　這一系列的證據(jù)表明干細胞存在可塑性。然而，近幾年來，部分研究學(xué)者對干細胞的可塑性提出了不同的看法:(1)細胞自發(fā)融合導(dǎo)致“可塑性”。英國科學(xué)家2002年,Ying等［19］的研究結(jié)果表明, 胚胎干細胞在體外與神經(jīng)或HSC共同培養(yǎng)時,能自發(fā)地發(fā)生神經(jīng)或HSC與胚胎干細胞之間的融合,誘導(dǎo)NSC或HSC“橫向分化”為胚胎樣干細胞,然后展現(xiàn)出胚胎干細胞的表型特征與相應(yīng)功能。同年美國科學(xué)家Terada等［20］用充分的證據(jù)證明,骨髓細胞的多向分化是因為與胚胎干細胞融合所致,而不是骨髓細胞直接橫向分化的結(jié)果。這兩者的研究結(jié)果都表明，是由于發(fā)生了細胞融合，使所謂的成年組織干細胞具有了“可塑性”潛能。(2)成體干細胞的橫向分化是成體組織中余存的胚胎原始干細胞所致。2002年Jiang等［21］的研究結(jié)果證實,在成體組織中余存著一種數(shù)量稀少的胚胎樣原始干細胞,表達胚胎干細胞的標(biāo)志如Oct-4、Rex-1及SSEA-1,體外培養(yǎng)條件也類似于胚胎干細胞,所謂的成體組織干細胞的“可塑性”很可能是這些細胞所為。(3)2002年，在Science和Nature上連續(xù)刊發(fā)的幾篇文章指出，成體干細胞可塑性可能是實驗設(shè)計不嚴謹，判斷錯誤所致，認為所謂的成體干細胞可塑性缺乏科學(xué)依據(jù)。

　　3 干細胞的分離培養(yǎng)

　　由于干細胞的數(shù)目很少，因此需要在體外對干細胞進行非分化性增殖。干細胞的分離培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)是其生物學(xué)特征，包括形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征及其生物學(xué)表型。

　　干細胞的分離培養(yǎng)實驗主要是建立在老鼠的實驗上，早在二十世紀七八十年代就已從小鼠中分離出胚胎干細胞并在體外進行培養(yǎng)成功。近年來，國內(nèi)在這方面的研究也取得了一定的進展，主要是在神經(jīng)干細胞等成體干細胞的研究上。2002年陳雷等［22］應(yīng)用無血清培養(yǎng)技術(shù)從胎鼠脊髓分離到的神經(jīng)系統(tǒng)的干細胞具有不斷分裂增殖的能力, 可被神經(jīng)干細胞特異性抗體所標(biāo)記, 并在血清條件下分裂為神經(jīng)系統(tǒng)多種細胞。2004年馮玉萍等［23］用胰酶消化加機械吹打分離大鼠大腦皮質(zhì)及皮質(zhì)下組織,之后用懸浮培養(yǎng)法、有限稀釋法獲得來源于同一細胞的亞細胞系克隆; 2005年肖美玲等［24］用同樣的方法分離新生昆明種小鼠(出生24 h 內(nèi)) 的大腦組織，利用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)細胞,獲得具有自我增殖能力的細胞克隆,兩者經(jīng)用免疫細胞化學(xué)法鑒定為神經(jīng)干細胞。

　　雖然老鼠的干細胞體外培養(yǎng)實驗已經(jīng)取得了可喜的進展，但人的干細胞的體外培養(yǎng)直到1995年,Thomson等從恒河猴的囊胚中分離,建立了第一個靈長類動物的胚胎干細胞株后，才獲得成功并得到迅速的發(fā)展。1998年,Thomson［1］和Gearhart［2］分別用胚胎干細胞和胚胎生殖細胞建立了人的胚胎干細胞系,在體細胞與生殖細胞間架起了橋梁,為研究胚胎干細胞的發(fā)育,在體外培養(yǎng)人體細胞和組織,利用ES細胞治療疾病提供了廣闊的發(fā)展前景。在報道分離了人的胚胎干細胞這一重大成果后不久,美國Advance Cell Technology (ACT, Worcester, M)的研究者宣稱,他們通過使人的皮膚細胞和牛的卵細胞雜交,培育出了人的胚胎干細胞。所用的方法與克隆實驗中采用的方法相似,基本上是對人的細胞重新編程并使其回到它最初的原始狀態(tài)。該發(fā)現(xiàn)可能導(dǎo)致許多新方法的產(chǎn)生,如通過移植和細胞治療來醫(yī)治疾病。2002年李巍等［25］采用無血清培養(yǎng)技術(shù), 成功地分離培養(yǎng)了人胚胎大腦皮層神經(jīng)干細胞，且能被誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。經(jīng)傳12代后仍具干細胞特性。2004年王共先等［26］以器官捐獻者的正常前列腺為研究對象,利用免疫磁珠細胞成功從前列腺基底細胞中分離前列腺干細胞。同年汪泱等［27］和羅樹偉等［28］均成功分離培養(yǎng)了人胚腦神經(jīng)干細胞，并進行進一步的檢測和研究。

　　4 干細胞的應(yīng)用

胚胎干細胞是細胞的源頭,具有多能或全能性,并能夠無限分化,能夠制造機體需要的全部細胞,因此在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)上具有巨大潛力,應(yīng)用前景廣闊。但它存在著移植免疫排斥的限制和倫理學(xué)方面的困擾, 而成體干細胞只能在體外有限擴增,多系分化效力低,通過體外的擴增培養(yǎng)雖能夠提高轉(zhuǎn)化效率, 然而體外轉(zhuǎn)化是否會引起干細胞遺傳特性的改變尚不清楚。 但這類干細胞存在于宿主體內(nèi),可直接從患者自身獲得,故無移植免疫排斥的限制也無倫理學(xué)方面的困擾,因此胚胎干細胞和成體干細胞的研究對生命科學(xué)領(lǐng)域而言,都具有極重要的意義。

　　4.1 為發(fā)育生物學(xué)研究提供良好的體外模型系統(tǒng)哺乳動物胚胎體積較小，而且在子宮內(nèi)進行發(fā)育，因此很難在動物體內(nèi)連續(xù)動態(tài)地研究其早期胚胎發(fā)育、細胞組織分化及基因表達調(diào)控， 而來源于胚胎的胚胎干細胞具有發(fā)育全能性、可操作性及無限擴增的特性，因此胚胎干細胞提供了在細胞和分子水平上研究個體發(fā)育過程中極早期事件的良好材料和方法。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過比較胚胎干細胞不同發(fā)育階段的干細胞和分化細胞的基因轉(zhuǎn)錄和表達，可確定胚胎發(fā)育及細胞分化的分子機制、發(fā)現(xiàn)新基因。結(jié)合基因打靶技術(shù)，可發(fā)現(xiàn)不同基因在生命活動中的功能等。

　　4.2 在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用理論上講，干細胞可以用于臨床細胞移植治療各種疾病和構(gòu)建人工組織或器官，其最適合的疾病主要是組織壞死性疾病如缺血引起的心肌壞死、腫瘤，退行性病變?nèi)缗两鹕�綜合征，自體免疫性疾病如胰島素依賴型糖尿病等。應(yīng)用干細胞治療疾病較傳統(tǒng)方法具有很多優(yōu)點：低毒性或無毒性，一次藥有效；不需要完全了解疾病發(fā)病的確切機理；不存在傳播疾病的風(fēng)險：還可能應(yīng)用自身干細胞移植，避免產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。
　　
　　1999年Horwitz等［29］用骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）治療遺傳性骨缺陷病，并取得了一定效果。2004年9月，意大利一名5歲、患有地中海貧血癥的男孩盧卡，科學(xué)家通過從其弟弟的胎盤血中提取干細胞移植到盧卡身上，使其戰(zhàn)勝病魔，完全治愈。

　　4.3 生產(chǎn)克隆動物的高效材料胚胎干細胞是動物克隆的優(yōu)良核供體。胚胎干細胞可以無限傳代和增殖而不失去其基因型和表現(xiàn)型,以其作為核供體進行核移植后在短期內(nèi)可獲得大量基因型和表現(xiàn)型完全相同的個體。胚胎干細胞與胚胎嵌合生產(chǎn)克隆動物可解決哺乳動物遠緣雜交的困難問題。另外,由于體細胞克隆動物存在成功率低、早衰、易缺陷易突變等問題，且多是致命的,使胚胎干細胞的克隆研究仍十分重要。1999年Wakayaama等［30］用長期傳代的小鼠胚胎干細胞克隆出31只小鼠，14只存活，存活率比體細胞克隆高。

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