銀杏萜類內(nèi)酯含量測(cè)定使用外標(biāo)四點(diǎn)法可靠性的探討

銀杏萜類內(nèi)酯含量測(cè)定使用外標(biāo)四點(diǎn)法可靠性的探討

作者:黃喆雯，唐欽強(qiáng)，王存芳

【摘要】 目的 探討外標(biāo)四點(diǎn)法的可行性。方法 HPLC法，色譜柱：ALLTECH　C18(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相：正丙醇-四氫呋喃-水(1：15：85)，流速1.0ml/min，ELSD參數(shù)：漂移管溫度108.0℃；載氣(壓縮空氣)流速3.10L/min。結(jié)果 外標(biāo)四點(diǎn)法得出回歸方程，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法證明成立，且相關(guān)系數(shù)r顯著。結(jié)論 外標(biāo)四點(diǎn)法可以用于銀杏萜類內(nèi)酯的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】 銀杏葉萜類內(nèi)酯；含量測(cè)定；HPLC-ELSD；外標(biāo)四點(diǎn)法

Study on reliability of ESM of four points to determine the assay for Ginkgo Terpene Lactones

【Abstract】 Objective Study on the reliability of ESM of four points.Methods HPLC system consisting of an Alltech C18 column(4.6mm×250mm，5μm)，and the mobile phase was n-Propyl alchol，tetrahydrofuran and water (1:15:84) at flow rate of 1.0ml/min.The detector temperature was 108.0℃ and the dry gas flow rate was 3.10L/min.Results The ESM of four points has been established.Conclusion The ESM of four points can be used on determine the assay for Ginkgo Terpene Lactones.

【Key words】 ginkgo terpene lactones；assay；HPLC-ELSD；ESM of four points

有關(guān)銀杏葉中萜類內(nèi)酯的含量測(cè)定方法的報(bào)道較多，目前銀杏葉制劑的萜類內(nèi)酯含量測(cè)定方法采用的多為HPLC法［1～3］。我們亦采用2005版中國(guó)藥典收錄的HPLC法［4］，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。HPLC-ELSD使用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程分別計(jì)算白果內(nèi)酯、銀杏葉內(nèi)酯A、銀杏葉內(nèi)酯B和銀杏葉內(nèi)酯C的含量，四種銀杏內(nèi)酯的含量之和為萜類內(nèi)酯含量。我們?cè)趯?shí)際工作中使用外標(biāo)兩點(diǎn)法時(shí)，直接從數(shù)值上難以判斷對(duì)照溶液的配制是否準(zhǔn)確，及其外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)應(yīng)的工作曲線(n＝2)是否可靠。因此，同時(shí)配制兩份對(duì)照溶液各自分別測(cè)定5μl、10μl兩點(diǎn)，將四個(gè)濃度和相應(yīng)峰面積一條標(biāo)準(zhǔn)曲線（n＝4），得出回歸方程及相關(guān)系數(shù)r，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法考察曲線和回歸方程是否成立［5］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀：SHIMADZU-10A；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器ALLTECH ELSD2000。

1.2 試藥 白果內(nèi)酯，銀杏葉內(nèi)酯B、銀杏葉內(nèi)酯C對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；銀杏葉內(nèi)酯A對(duì)照品購(gòu)于SIGMA。甲醇為色譜純；水為自制超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱：ALLTECH C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：正丙醇-四氫呋喃-水(1：15：84)；流速1.0ml/min；ELSD參數(shù)：漂移管溫度108.0℃；載氣(壓縮空氣)流速3.10L/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量5、15μl。理論塔板數(shù)按白果內(nèi)酯峰計(jì)算應(yīng)不低于2500，相鄰峰的分離度應(yīng)＞1.5。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過夜的白果內(nèi)酯、銀杏葉內(nèi)酯A、銀杏葉內(nèi)酯B和銀杏葉內(nèi)酯C對(duì)照品適量，置同一10ml量瓶中加甲醇稀釋至刻度，混勻，即得。

2.2.1 對(duì)照品溶液一 白果內(nèi)酯22.73mg、銀杏內(nèi)酯A 13.42mg、銀杏內(nèi)酯B 11.13mg和銀杏內(nèi)酯C 9.05mg。

2.2.2 對(duì)照品溶液二 白果內(nèi)酯14.71mg、銀杏內(nèi)酯A 11.34mg、銀杏內(nèi)酯B 12.24mg和銀杏內(nèi)酯C 18.99mg。

以對(duì)照品濃度的自然對(duì)數(shù)InC(x)為橫坐標(biāo)，峰面積的自然對(duì)數(shù)InA(y)為縱坐標(biāo)作圖，見圖2～5。

圖中四點(diǎn)有成一條直線的趨勢(shì)，在直線方程y＝ax b中，通過統(tǒng)計(jì)計(jì)算按公式1、2、3分別求出兩個(gè)常數(shù)a，b及直線的相關(guān)系數(shù)r，見表2。

2.3 外標(biāo)四點(diǎn)法直線回歸方程的確定 分別精密吸取對(duì)照品溶液一和二5μl、15μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果：對(duì)照溶液中白果內(nèi)酯(tR＝8.375)、銀杏葉內(nèi)酯A(tR＝9.811)、銀杏葉內(nèi)酯B(tR=12.040)和銀杏葉內(nèi)酯C(tR＝7.194)，相鄰組分分離效果良好(見圖1)。濃度與峰面積的數(shù)據(jù)及處理見表1。

圖1 萜類內(nèi)酯對(duì)照溶液HPLC圖

(出峰順序?yàn)殂y杏內(nèi)酯C，白果內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯A，銀杏內(nèi)酯B)

表1 對(duì)照進(jìn)樣量(μg)與峰面積

圖2~5

1

2.4 直線回歸方程的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)

2.4.1 相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)法 相關(guān)系數(shù)表示兩變量間關(guān)系的密切程度。使用相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)法來(lái)進(jìn)行相關(guān)系數(shù)的顯著性測(cè)驗(yàn)。見表2。

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