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雙氟胞苷對(duì)兔晶狀體上皮細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制作用
作者：于海濤 王亞玲 楊青 閻洪祿
【摘要】 目的探討雙氟胞苷對(duì)培養(yǎng)的兔晶狀體上皮細(xì)胞(RLECs)體外生長(zhǎng)的抑制作用，為臨床防治后發(fā)性白內(nèi)障提供理論依據(jù)。方法在第3代體外培養(yǎng)RLECs中加入不同濃度雙氟胞苷，采用MTT比色法及血細(xì)胞板計(jì)數(shù)法觀察不同濃度的雙氟胞苷對(duì)體外培養(yǎng)的RLECs增殖的抑制作用。結(jié)果濃度為64 mg/L雙氟胞苷在24 h對(duì)RLECs無(wú)明顯的抑制作用;濃度為128~4 096 mg/L的雙氟胞苷在24、48、72 h對(duì)RLECs有明顯的抑制作用，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.248~34.090，q=2.188~11.353，P<0.05)。在同一作用時(shí)間隨雙氟胞苷濃度的增高，對(duì)RLECs的抑制作用逐漸增強(qiáng)，各濃度之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=2.122~10.524，P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)濃度的雙氟胞苷對(duì)RLECs的抑制作用隨作用時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，在72 h抑制作用最強(qiáng)。MTT比色法結(jié)果與血細(xì)胞板計(jì)數(shù)法結(jié)果一致。結(jié)論雙氟胞苷可抑制體外培養(yǎng)RLECs的增殖，可用于抑制、預(yù)防后發(fā)性白內(nèi)障的形成。
【關(guān)鍵詞】 雙氟胞苷;晶體;上皮細(xì)胞;細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù);兔
[ABSTRACT]ObjectiveTo study the depressant effect of Gemcitabine on the cells of rabbit epithelium lentis (REL) in vitro, and provide a theoretical evidence for treatment of aftercataract.MethodsThe cells of REL were cultured in vitro, and different concentrations of Gemcitabine were added into the cells of the third generation. The effect of Gemcitabine at different concentrations on the cells was measured with MTT staining colorimetry and cell count technique.ResultsThe Gemcitabine at the concentration of 64 mg/L for 24 h did not show inhibition on cells of REL (P>0.05); at 128-4 096 mg/L for 24 h, 48 h, and72 h showed obvious inhibition (F=22.248-34.090,q=2.188-11.353,P<0.05), the differences were significant as compared with the control. Under the same-time condition, the inhibitory action increased with the increase of the concentration of Gemci-tabine, the differences among different concentrations were significant (q=2.122-10.524,P<0.05). With the same concentration, the effect of prohibition depended on time. The result of MTT was consistent to that of cell count technique.ConclusionGemcitabine depresses the growth of REL cells cultured in vitro, which can be used to inhibit and prevent secondary cataract.
[KEY WORDS]gemcitabine; lens, crystalline; epithelial cell; cell culture technique; rabbits
后發(fā)性白內(nèi)障是白內(nèi)障囊外摘除術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥,也是影響病人術(shù)后視力的最主要原因之一，其術(shù)后1、3、5年的白內(nèi)障發(fā)生率在成人可以高達(dá)11.8%、20.7%、28.5%[1-2]。有關(guān)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，術(shù)后殘留的晶狀體上皮細(xì)胞的增殖和遷移，轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，可能是形成后發(fā)性白內(nèi)障的主要原因之一[3-4]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察雙氟胞苷對(duì)培養(yǎng)的兔晶狀體上皮細(xì)胞(RLECs)體外生長(zhǎng)的抑制作用，為臨床防治后發(fā)性白內(nèi)障提供理論依據(jù)。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取實(shí)驗(yàn)用家兔10只，體質(zhì)量為1.5～2.5 kg，雌雄不限，由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。
1.1.2主要試劑與藥品DMEM干粉培養(yǎng)基(GIBCO BRL 公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，胰蛋白酶(GIBCO BRL 公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma 公司)，雙氟胞苷(美國(guó)禮萊亞洲公司)，青霉素鈉(華北制藥有限公司)，硫酸鏈霉素和硫酸慶大霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)。
1.2方法
1.2.1培養(yǎng)液的配制將DMEM干粉培養(yǎng)基加入1 000 mL三蒸水配制成DMEM培養(yǎng)液，加入滅活的小牛血清,使之成為含體積分?jǐn)?shù)0.150小牛血清的培養(yǎng)液，4 ℃冰箱保存。MTT溶液: 將MTT474用PBS液溶解，濃度為5 mg/L,兩層微孔濾膜過(guò)濾除菌，4 ℃避光保存。
1.2.2RLECs的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用兔空氣栓塞致死后，完整摘除眼球，在超凈工作臺(tái)內(nèi)取出晶狀體，分離出連著晶狀體赤道部的前囊膜。將晶狀體前囊膜剪成組織碎片，均勻鋪貼于培養(yǎng)瓶底壁，加入培養(yǎng)液置于培養(yǎng)箱中，至細(xì)胞游出相互融合，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取培養(yǎng)的第3代RLECs，制成細(xì)胞懸液，用血細(xì)胞板觀察四角大方格的細(xì)胞數(shù)[5-7]。
1.2.3實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)條件培養(yǎng)液的不同，隨機(jī)分為8組，陰性對(duì)照組(無(wú)血清培養(yǎng)液)和濃度為64、128、256、512、1 024、2 048、4 096 mg/L的雙氟胞苷無(wú)血清培養(yǎng)液組。
1.2.4RLECs計(jì)數(shù)①血細(xì)胞板計(jì)數(shù)法[8]：將RLECs懸液調(diào)整到細(xì)胞密度為2.5×107/L，平行接種到24孔培養(yǎng)板上，每孔1 mL，平行3個(gè)，放入CO2培養(yǎng)箱中10 h后取出，棄上清液，8組分別加入條件培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。分別于培養(yǎng)24、48、72 h后棄去條件培養(yǎng)液，加胰酶消化后，每孔加D-Hanks液1 mL，將細(xì)胞吹打均勻，用血細(xì)胞板計(jì)數(shù)，每孔計(jì)數(shù)8次，取平均值。②MTT比色法[9-11]：將RLECs懸液調(diào)整到細(xì)胞密度為5×107/L。平行接種于96孔培養(yǎng)板，平行3個(gè)，每板分為9組，每組6孔，第1組為200 μL不含細(xì)胞的空白對(duì)照組，其余8組分別加入200 μL上述密度的細(xì)胞培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)0.150小牛血清)，每孔細(xì)胞數(shù)約為5×103個(gè)，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。10 h后，分別將含有細(xì)胞的8組培養(yǎng)液棄去，按實(shí)驗(yàn)分組加入條件培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于24、48、72 h后棄去上清液，每孔再加20 μL濃度為5 g/L的MTT液，3 h后終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)200 μL，在震蕩器上震蕩30 min，使結(jié)晶物充分溶解，在全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。結(jié)果以MTT比色法測(cè)定值減去空白對(duì)照組測(cè)定值表示。
1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 12.0及PPMS 1.5[12]軟件處理，組間比較采用方差分析。
2結(jié)果
2.1正常培養(yǎng)的RLECs形態(tài)學(xué)觀察
組織碎片在接種24~48 h后可見(jiàn)細(xì)胞游走出植片邊緣，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸增多，隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞密度增大，最初在靠近植片處，細(xì)胞呈團(tuán)狀，3~4 d后大部分植片上的細(xì)胞游走出植片，圍繞植片生長(zhǎng)。6~7 d細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，10 d左右形成圍繞植片的單層上皮細(xì)胞，鋪滿瓶底，達(dá)到融合狀態(tài)。原代培養(yǎng)的晶狀體上皮細(xì)胞呈透明狀，多角形或六邊形，保持上皮細(xì)胞的特征。傳代細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，單個(gè)細(xì)胞為圓形，6 h左右開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，24 h后約80%細(xì)胞貼壁，細(xì)胞增殖迅速，3~4 d達(dá)到融合。2~4代的晶狀體上皮細(xì)胞貼壁迅速，增殖快，生長(zhǎng)良好，呈展開(kāi)透明狀，排列不規(guī)則，與原代細(xì)胞無(wú)明顯差別，傳至6代后，細(xì)胞貼壁時(shí)間延長(zhǎng)，晶狀體上皮細(xì)胞變?yōu)槌衫w維細(xì)胞形狀，呈長(zhǎng)梭形、長(zhǎng)條狀，細(xì)胞大量增殖，中間出現(xiàn)拉網(wǎng)現(xiàn)象。
2.2雙氟胞苷對(duì)RLECs增殖的影響
2.2.1雙氟胞苷對(duì)RLECs形態(tài)學(xué)的影響 與陰性對(duì)照組比較，濃度為64 mg/L的雙氟胞苷作用于RLECs 24 h后，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異;濃度為128～4 096 mg/L時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，視野中所見(jiàn)細(xì)胞稀疏，細(xì)胞體積略小，細(xì)胞基質(zhì)較對(duì)照組亦減少。隨時(shí)間的延長(zhǎng)，上述現(xiàn)象更加明顯，實(shí)驗(yàn)組在藥物作用48 h后，細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少，細(xì)胞收縮呈圓形，細(xì)胞基質(zhì)減少;在藥物作用72 h后，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞基質(zhì)較24、48 h均明顯減少，在4 096 mg/L組中，視野中偶見(jiàn)小圓形細(xì)胞及稀疏的細(xì)胞基質(zhì)。
2.2.2血細(xì)胞板計(jì)數(shù)結(jié)果在24 h 時(shí)64 mg/L雙氟胞苷對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用，與陰性對(duì)照組比較無(wú)顯著意義(P>0.05)。64 mg/L雙氟胞苷在48、72 h時(shí)，128～4 096 mg/L雙氟胞苷在24、48、72 h時(shí)對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞均有明顯的抑制作用，與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.248~34.090，q=2.188~11.353，P<0.05)。在同一作用時(shí)間內(nèi)隨雙氟胞苷濃度的增高，對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，各濃度之間比較差異有顯著性(q=2.122~10.524，P<0.05)。各濃度雙氟胞苷對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞抑制作用，隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，從雙氟胞苷對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的抑制作用血細(xì)胞板計(jì)數(shù)結(jié)果曲線來(lái)看，在72 h抑制作用最強(qiáng)。見(jiàn)圖1。
2.2.3MTT比色法結(jié)果在24 h 時(shí)64 mg/L雙氟胞苷對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用，與陰性對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。64 mg/L雙氟胞苷在48、72 h，128～4 096 mg/L雙氟胞苷在24、48、72 h對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞均有明顯的抑制作 用，與陰性對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.435~290.688，q=3.133~37.001，P<0.05)。
3討論
近年來(lái)，針對(duì)后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)制，許多學(xué)者采用多種方法從不同的方向進(jìn)行研究，尤其是針對(duì)抑制殘留晶狀體上皮細(xì)胞增殖的藥物研究成為大家關(guān)注的熱點(diǎn)。白內(nèi)障術(shù)后殘留的晶狀體上皮細(xì)胞在晶狀體囊膜上的增生、移行、產(chǎn)生膠原，是白內(nèi)障摘除人工晶狀體植入眼發(fā)生后發(fā)性白內(nèi)障的主要原因，晶狀體上皮細(xì)胞增生移行至后囊可導(dǎo)致后囊混濁的形成[13-14]。
雙氟胞苷又稱吉西他濱(2，2-二氟脫氧雙氟胞嘧啶核苷)，是一種新的胞嘧啶核苷衍生物，主要代謝產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)參入DNA，主要作用于G1/S期。雙氟胞苷能抑制核苷酸還原酶，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脫氧核苷三磷酸酯減少，尚能抑制脫氧胞嘧啶脫氨酶減少細(xì)胞內(nèi)代謝物的降解，具有自我增效的作用，其對(duì)多種腫瘤有效。
本實(shí)驗(yàn)主要采用雙氟胞苷局部用藥的方式，可以減少或消除全身用藥的副作用，另外可以提高藥物局部的濃度，更好地發(fā)揮雙氟胞苷對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的作用，為今后進(jìn)一步體內(nèi)應(yīng)用雙氟胞苷打下了理論基礎(chǔ)。
本實(shí)驗(yàn)采用血細(xì)胞板計(jì)數(shù)法及MTT定量法觀察了雙氟胞苷對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞增殖影響，兩種方法所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相同，都顯示了雙氟胞苷在低濃度(64 mg/L)對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用，與陰性對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，隨著雙氟胞苷濃度的增高其抑制晶狀體上皮細(xì)胞增殖的作用逐漸增強(qiáng)，在24、48、72 h對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞均有明顯的抑制作用，與陰性對(duì)照組比較，差異有顯著性(P<0.05)，說(shuō)明雙氟胞苷對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的抑制作用呈劑量依賴性。從MTT比色法A值曲線可以看出，同一濃度雙氟胞苷對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的抑制作用在72 h作用最強(qiáng)，呈時(shí)間依賴性。
綜上所述，雙氟胞苷可抑制體外培養(yǎng)RLECs的增殖，并可因此抑制、預(yù)防后發(fā)性白內(nèi)障的形成。因人晶狀體上皮細(xì)胞與RLECs的不同，且體外培養(yǎng)與活體的生理?xiàng)l件有諸多不同，需進(jìn)一步研究其在人體的作用。雙氟胞苷有望成為預(yù)防后發(fā)性白內(nèi)障的藥物之一。
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