獻(xiàn)血者EBV、HHV?6和HHV?7 DNA檢測(cè)對(duì)輸血意義
作者：楊永潔 尼宏莉 李欣 王笑峰 王云 于琦 羅兵
【摘要】 目的 了解青島地區(qū)獻(xiàn)血者單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）和唾液標(biāo)本中EB病毒(EBV)、人皰疹病毒6型(HHV?6)和人皰疹病毒7型(HHV?7)的感染情況。方法 采用PCR?Southern blotting檢測(cè)109名健康無(wú)償獻(xiàn)血者外周血PBMC和唾液標(biāo)本中EBV DNA，巢式 PCR技術(shù)檢測(cè)HHV?6和HHV?7 DNA，限制性酶切分析分別對(duì)HHV?6、HHV?7進(jìn)行分型和鑒定。結(jié)果 109名獻(xiàn)血者外周血PBMC中EBV DNA檢出率為21.10%(23/109)，HHV?6 DNA檢出率為50.46%(55/109)，HHV?7 DNA檢出率為57.80%(63/109)。唾液標(biāo)本中EBV、HHV?6和HHV?7 DNA檢出率分別為24.77%(27/109)、 66.06%(72/109)和90.83%(99/109)。PBMC中EBV、HHV?6和HHV?7均陽(yáng)性者7例，占6.4%；唾液標(biāo)本中均陽(yáng)性者17例，占15.6％。酶切分析結(jié)果顯示，55例獻(xiàn)血者外周血PBMC HHV?6陽(yáng)性標(biāo)本中HHV?6A型占18.2%(10/55)，HHV?6B型占81.8%(45/55)；72例唾液HHV?6陽(yáng)性標(biāo)本中HHV?6A型占16.7%(12/72)，HHV?6B型為83.3%(60/72)。結(jié)論 外周血PBMC和口咽部上皮細(xì)胞是EBV、HHV?6和HHV?7潛伏的重要部位，獻(xiàn)血員中存在上述病毒的共感染。
【關(guān)鍵詞】 皰疹病毒4型,人；皰疹病毒6型，人；皰疹病毒7型，人；輸血
�。跘BSTRACT］ Objective To investigate the prevalence of EBV,HHV?6 和 HHV?7 in peripheral blood mononuclear cel1s (PBMC) and saliva samples in blood donor. Methods PCR?Southern blotting was adopted to detect EBV DNA in PMBC and saliva of 109 blood donors in Qingdao; nested?PCR method to detect HHV?6 and HHV?7 DNA; restriction map to type and identify HHV?6 and HHV?7. Results Of the 109 blood donors, the detection rates of EBV DNA, HHV?6 DNA and HHV?7 DNA in PMBC were 21.10% (23/109), 50.46% (55/109) and 57.80% (63/109), respectively; in saliva, the rates were 24.77% (27/109),66.06% (72/109) and 90.83% (99/109), respectively. In PBMC, seven cases were with all the three items, EBV,HHV?6 and HHV?7, were positive, accounting for 6.4% (7/109); in saliva, the positive case was 17, accounting for 15.6％ (17/109). Restriction enzyme analysis revealed that 18.2% (10/55) of HHV?6A in PBMC and 16.7% (12/72) in saliva, 81.8%(45/55) of HHV?6B in PBMC and 83.3%(60/72) in saliva. Conclusion Peripheral blood mononuclear cel1s and epithelial cells of pharynx oralis are the important latent sites for EBV,HHV?6 and HHV?7. Co?infection of EBV with HHV?6 and HHV?7 exists in blood donors.
［KEY WORDS］ herpesvirus 4, human; herpesvirus 6, human; herpesvirus 7, human; blood transfusion
輸血治療是臨床醫(yī)學(xué)的重要手段之一，但輸血并不是有益無(wú)害的治療手段，也不是絕對(duì)安全的[1]。輸血所致病毒感染一直為國(guó)內(nèi)外輸血界所關(guān)注，因此，與輸血相關(guān)的病毒感染的危險(xiǎn)性及檢測(cè)病毒基因組的價(jià)值已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)研究熱點(diǎn)[2]。EB病毒（EBV）、人皰疹病毒6型（HHV?6）和7型（HHV?7）同屬于人皰疹病毒科，原發(fā)感染后在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期潛伏，可因輸血或某些癥狀性疾病而激活，增加其再活動(dòng)的危險(xiǎn)度。大部分健康成人感染并攜帶EBV、HHV?6和HHV?7，病毒可持續(xù)存在于外周血細(xì)胞和唾液腺細(xì)胞中，而且唾液中可分泌具有感染性的病毒顆粒，對(duì)人體產(chǎn)生持久而穩(wěn)定的感染。本研究采用PCR?Southern blotting檢測(cè)109名健康無(wú)償獻(xiàn)血者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和唾液標(biāo)本中EBV DNA，巢式 PCR(nested?PCR)技術(shù)結(jié)合限制性酶切分析檢測(cè)其HHV?6和HHV?7 DNA，以調(diào)查獻(xiàn)血員EBV、HHV?6和HHV?7的感染狀況，分析其是否存在共感染及對(duì)輸血的意義。
1 材料與方法
1.1 樣本來(lái)源
隨機(jī)采集青島地區(qū)109名無(wú)償獻(xiàn)血者外周靜脈血 10 mL (枸櫞酸鈉抗凝，比例1∶9)和唾液5 mL。109名獻(xiàn)血者丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）≤25 U(賴氏法)，HBsAg、抗?HCV、抗?HIV和梅毒螺旋體抗體均陰性，其他項(xiàng)目也均符合國(guó)家規(guī)定獻(xiàn)血標(biāo)準(zhǔn)。
1.2 標(biāo)本DNA的提取
枸櫞酸鈉抗凝血分離PBMC，唾液標(biāo)本離心取沉淀，分別加入2 mL裂解緩沖液（含10 mmol/L Tris?HCl，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，100 mg/L 蛋白酶K，1 g/L SDS），55 ℃消化2 h。采用酚?氯仿?異戊醇法常規(guī)提取細(xì)胞DNA，干燥后以TE緩沖液（pH 8.0）溶解，4 ℃保存?zhèn)溆谩?
1.3 EBV、HHV?6和HHV?7 DNA的檢測(cè)
EBV特異性引物和探針參照文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)，上游引物序列為5′?CCAGACAGCAGCCAATTGTC?3′，下游引物序列為5′?GGTAGAAGACCCCCTCT?TAC?3′，探針序列為5′?CCCTGGTATAAAGTGGTCCTGCAGCTATTTCTGGTCGCATC?3′，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為129 bp。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系及Sou?thern boltting檢測(cè)EBV DNA均參考文獻(xiàn)[3]方法進(jìn)行。巢式PCR擴(kuò)增HHV?6 和HHV?7 DNA內(nèi)外側(cè)引物的設(shè)計(jì)和擴(kuò)增條件分別參考文獻(xiàn)[4?5]進(jìn)行，HHV?6外側(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為287 bp，內(nèi)側(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為163 bp；HHV?7外側(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為186 bp，內(nèi)側(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為124 bp。
1.4 HHV?6限制性酶切分型和HHV?7鑒定
HHV?6酶切反應(yīng)的體積為20 μL，包括10×buffer 2 μL，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，限制性核酸內(nèi)切酶Hind Ⅲ 10 U，去離子水補(bǔ)充體積至20 μL，混勻后瞬時(shí)離心，37 ℃水浴12～16 h。取酶切產(chǎn)物10 μL于120 g/L聚丙烯酰胺凝膠中80 V垂直電泳1 h，凝膠用EtBr （0.5 mg/L）染色20 min，紫外線透射儀下觀察并記錄電泳結(jié)果。HHV?6A可觀察到66 bp和97 bp的條帶，而HHV?6B未被消化，為163 bp的PCR擴(kuò)增條帶。HHV?7 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ進(jìn)行酶切鑒定，反應(yīng)條件和電泳條件同上，HHV?7特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可觀察到45 bp和79 bp的兩條帶。
2 結(jié)果
2.1 EBV DNA的PCR?Southern檢測(cè)
本文109名獻(xiàn)血者 PBMC中EBV DNA陽(yáng)性23例，陽(yáng)性率為21.10%；唾液標(biāo)本中EBV DNA陽(yáng)性27例，陽(yáng)性率為24.77%；PBMC和唾液標(biāo)本中均陽(yáng)性者4例，合計(jì)陽(yáng)性率42.2%（46/109）。見表1、2。部分標(biāo)本PCR?Southern結(jié)果見圖1。獻(xiàn)血員EBV、HHV?6和HHV?7感染狀況見表2。PBMC和唾液標(biāo)本中EBV檢出率差異無(wú)顯著性(χ2=0.42，P>0.05)，而HHV?6和HHV?7在唾液標(biāo)本中的檢出率明顯高于PBMC標(biāo)本，差異有顯著性（χ2=5.45、31.14，P<0.05、0.01）。
2.2 HHV?6 DNA檢測(cè)結(jié)果和分型
109例獻(xiàn)血員外周血PBMC中外側(cè)PCR均未檢測(cè)到HHV?6基因組，內(nèi)側(cè)PCR擴(kuò)增有55例HHV?6 DNA陽(yáng)性，陽(yáng)性率為50.46%（55/109）；唾液標(biāo)本中外側(cè)PCR擴(kuò)增有2例陽(yáng)性，內(nèi)側(cè)PCR擴(kuò)增有70例HHV?6 DNA陽(yáng)性，陽(yáng)性率為66.06%（72/109），PBMC和唾液標(biāo)本均陽(yáng)性者34例，合計(jì)陽(yáng)性率85.32%（93/109），見表1、2。部分外周血PBMC標(biāo)本和唾液標(biāo)本HHV?6內(nèi)側(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2。PCR產(chǎn)物酶切分析顯示，外周血PBMC HHV?6陽(yáng)性的標(biāo)本中，HHV?6A型占18.2%(10/55)，HHV?6B型占81.8%(45/55)；而在72例唾液HHV?6陽(yáng)性的標(biāo)本中，HHV?6A型占16.7%(12/72)，HHV?6B型占83.3%(60/72)，本文未觀察到HHV?6A和HHV?6B均為陽(yáng)性者。
2.3 HHV?7 DNA的檢測(cè)與鑒定
本文109例獻(xiàn)血員外周血PBMC中外側(cè)PCR擴(kuò)增有21例標(biāo)本HHV?7 DNA陽(yáng)性，內(nèi)側(cè)PCR擴(kuò)增有42例HHV?7 DNA陽(yáng)性，陽(yáng)性率為57.80% (63/109)；在唾液標(biāo)本中，外側(cè)PCR擴(kuò)增有85例HHV?7 DNA陽(yáng)性，內(nèi)側(cè)PCR擴(kuò)增有14例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為 90.8%（99/109）；在PBMC和唾液標(biāo)本中，HHV?7 DNA均陽(yáng)性者共有63例，其合計(jì)陽(yáng)性率為90.8%（99/109）。見表1、2。部分外周血PBMC和唾液標(biāo)本HHV?7內(nèi)側(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖3。表1 109例獻(xiàn)血員PBMC和唾液標(biāo)本中EBV、HHV?6和HHV?7檢出率、表2 109例獻(xiàn)血員PBMC和唾液標(biāo)本中EBV、HHV?6和HHV?7感染情況（略）
2.4 EBV、HHV?6和HHV?7共感染狀況
109名獻(xiàn)血員外周血PBMC中EBV、HHV?6和HHV?7均陽(yáng)性者7例，占6.4%；唾液中均陽(yáng)性者17例，占15.6％。本文有58.7%的獻(xiàn)血員同時(shí)感染HHV?6和HHV?7，而單獨(dú)感染EBV的獻(xiàn)血員較少，在外周血和唾液標(biāo)本中分別只占2.75%和0.92%，唾液標(biāo)本中僅有1名獻(xiàn)血員3種病毒DNA檢測(cè)均為陰性。見表3。表3 獻(xiàn)血員血液、唾液EBV、HHV?6和HHV?7共感染狀況分析（略）
3 討論
EBV、HHV?6和HHV?7分別屬人皰疹病毒科γ和β亞科成員，其原發(fā)感染通常發(fā)生在嬰幼兒和兒童期，原發(fā)感染后可在體內(nèi)形成潛伏感染，主要通過(guò)唾液傳播，也可經(jīng)輸血傳播。由于輸血或外界原因?qū)е聶C(jī)體免疫力下降或免疫功能抑制時(shí)潛伏感染狀態(tài)的病毒可被激活，導(dǎo)致各種活動(dòng)性感染。其靶細(xì)胞均為免疫細(xì)胞，EBV主要侵犯B淋巴細(xì)胞，過(guò)去認(rèn)為只有B細(xì)胞表面有EBV受體，但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在腮腺管、咽以及宮頸外的某些上皮細(xì)胞亦有EBV受體，因此EBV亦可以感染上皮細(xì)胞[6]。HHV?6和HHV?7二者有一定程度的同源性，主要感染CD4+T細(xì)胞，在大多數(shù)正常人CD4+Ｔ細(xì)胞中以潛伏感染的形式存在，病毒被激活后傳播到其他細(xì)胞，而唾液腺中不斷產(chǎn)生的病毒可造成低水平持續(xù)感染[7]。
本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，在109名獻(xiàn)血員中EBV、HHV?6和HHV?7的檢出率均較高，其中HHV?6存在著株差異性，HHV?6的A、B兩個(gè)亞型廣泛存在于健康成人及兒童PBMC和唾液中，但在不同疾病中的流行情況有所不同。HHV?6原發(fā)感染多為B亞型所致，在幼兒急疹和骨髓移植病人中主要為B亞型，而在艾滋病及淋巴增生性疾病病人中，A亞型的檢出率則遠(yuǎn)高于B亞型。健康人群中HHV?6 B亞型毒株感染譜比A亞型廣泛，本研究主要為HHV?6B型，其檢出率為81.72%，與FOX等[9]報(bào)道的結(jié)果相似，說(shuō)明B亞型毒株感染譜比A亞型更廣泛。CUENDE等[10]應(yīng)用巢式PCR檢測(cè)獻(xiàn)血員PBMC中HHV?6的陽(yáng)性率為90%（18/20），其結(jié)果明顯高于本研究HHV?6的檢出率，推測(cè)健康成人HHV?6的感染率存在地區(qū)差異。青島地區(qū)獻(xiàn)血員PBMC中HHV?7檢出率為57.8%，與WILBORN等[11]報(bào)道的PBMC中HHV?7的陽(yáng)性檢出率為66.1%（74/112）相似。另外，在部分獻(xiàn)血員血細(xì)胞和唾液標(biāo)本中均可以檢測(cè)到EBV、HHV?6和HHV?7 DNA，表明3種病毒感染宿主后可以同時(shí)潛伏于唾液腺和PBMC中，并提示唾液和血液均可以傳播病毒[9]。而且唾液中HHV?6和HHV?7的檢出率明顯高于PBMC，提示與血液比較唾液的傳播可能具有更重要的意義。
此外，本研究結(jié)果顯示，在健康獻(xiàn)血員中存在EBV、HHV?6和HHV?7的共感染。EBV、HHV?6和HHV?7同屬于人類皰疹病毒家族，在結(jié)構(gòu)上有相似性，在發(fā)揮其生物學(xué)功能方面也有協(xié)同作用。有研究顯示，在DIHS病人中存在EBV、HHV?6和HHV?7的共感染，血清學(xué)檢測(cè)證實(shí)潛伏病毒可再活化，且HHV?6、HHV?7、CMV 和EBV再活化存在協(xié)同作用[12]。CHEN等[13]在研究人類皰疹病毒感染的解剖學(xué)圖譜時(shí)證實(shí)，在所有的皰疹病毒中只有EBV、HHV?6和HHV?7在8例不同原因死者(其中2例死于HIV?AIDS)中同時(shí)表達(dá)，而且是多部位表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明EBV、HHV?6和HHV?7存在共感染。
綜上所述，健康獻(xiàn)血員中EBV、HHV?6以及HHV?7的檢出率較高，輸注含有該病毒的血液可能增加受血者的機(jī)會(huì)性感染，特別是給器官移植病人或免疫功能低下病人帶來(lái)危害。采取科學(xué)的輸血方式，如輸注去除白細(xì)胞制備的成分血，可以最大限度地減少病毒傳播與感染引起的不良后果。探討EBV、HHV?6和HHV?7對(duì)降低輸血性疾病的危險(xiǎn)性具有重要意義。
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