瘦素及其受體在椎間盤組織的表達(dá)及意義

【摘要】  目的 探討瘦素及其受體在椎間盤組織表達(dá)及意義。方法 采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測正常椎間盤(21個(gè))與退變椎間盤(39個(gè))組織中瘦素及其受體的表達(dá)，用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測體外培養(yǎng)的纖維環(huán)細(xì)胞中瘦素及其受體的表達(dá)。結(jié)果 退變椎間盤組織中瘦素及其受體的表達(dá)高于正常椎間盤組織，差異有顯著性(t=3.223、5.553,P<0.05)。體外培養(yǎng)的纖維環(huán)細(xì)胞中可以檢測到瘦素及其受體表達(dá)。結(jié)論 椎間盤組織存在瘦素及其受體;瘦素可能在椎間盤退變中發(fā)揮作用。 
【關(guān)鍵詞】  瘦素;椎間盤;免疫組織化學(xué)
[ABSTRACT] Objective To study the expressions and their significance of leptin and leptin receptor in intervertebral disc. Methods Expressions of leptin and its receptor protein were detected in 21 normal intervertebral discs and 39 degenerative discs, and in human cells of annular fibrosus cultured in vitro, immunohistochemically and immunocytochemically, respectively. ResultsThe expressions of leptin and its receptor in degenerative discs were stronger than that of the normal discs (t=3.223,5.553;P<0.05), and that expressions could also be determined in the cells cultured in vitro. Conclusion Leptin and leptin receptor exist in the intervertebral disc tissue, which might play an important role in the process of the disc degeneration.
　　[KEY WORDS] leptin; intervertebral disc; immunohistochemistry
　　瘦素是肥胖基因編碼的肽類激素，體內(nèi)許多組織中有瘦素及其受體的表達(dá)。瘦素具有很多重要的生理作用，包括調(diào)節(jié)食欲、控制體質(zhì)量、調(diào)節(jié)機(jī)體炎性反應(yīng)和免疫功能及促細(xì)胞增殖等[1]。瘦素在肥胖的發(fā)生過程中扮演重要的角色。同時(shí)，研究證明肥胖也是椎間盤蛻變的重要危險(xiǎn)因素。椎間盤退變與骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程極為相似，其機(jī)制除了傳統(tǒng)的生物力學(xué)因素外,目前研究較多的生物化學(xué)因素可能也起著比較重要的作用�，F(xiàn)已證明關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞可以表達(dá)瘦素及其受體，并且瘦素可以刺激軟骨細(xì)胞的體外增殖，通過促進(jìn)骨贅形成參與骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程[2]，而瘦素在椎間盤退變過程中的作用報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)旨在探討瘦素系統(tǒng)在椎間盤中的表達(dá)及其在椎間盤退變發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　1 材料與方法
　　1.1 標(biāo)本及其來源
　　腰椎間盤標(biāo)本60個(gè),L3,4椎間盤6個(gè)，L4,5椎間盤31個(gè)，L5S1椎間盤23個(gè)。均來自于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2008年4月—2009年1月因腰椎間盤突出癥、腰椎外傷爆裂骨折經(jīng)手術(shù)治療的病人。所有病人均知情同意。病人中男27例,女24例;年齡21～59歲，平均41歲。所有病人術(shù)前均未行過硬膜外封閉、化學(xué)溶核及經(jīng)皮穿刺髓核切吸術(shù)。所取標(biāo)本包括纖維環(huán)和髓核。正常組21個(gè)，納入標(biāo)準(zhǔn)為：①術(shù)前MRI顯示所取的椎間盤組織T2加權(quán)像上Pfirrmann分級Ⅰ～Ⅲ級;②術(shù)前無神經(jīng)根刺激癥狀。退變組39個(gè)，納入標(biāo)準(zhǔn)為：①術(shù)前MRI顯示所取的椎間盤組織T2加權(quán)像Pfirrmann 分級Ⅳ～Ⅴ級;②術(shù)前存在明顯神經(jīng)根刺激癥狀。各標(biāo)本取出后置于40 g/L甲醛溶液中固定,Carnoy 液4 ℃過夜,不同梯度的乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。4～5 μm厚連續(xù)切片,以備蘇木精?伊紅染色和免疫組化檢測用。
　　1.2 方法
　　1.2.1 切片光鏡觀察 用蘇木精?伊紅常規(guī)染色。
　　1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 瘦素兔抗人多克隆抗體和瘦素受體羊抗人多克隆抗體購自Santa Cruze公司;Immunostain SP Kit試劑盒和DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。載玻片均經(jīng)多聚賴氨酸浸泡24 h防脫片處理,60 ℃烤箱烘烤干燥。切片常規(guī)進(jìn)行脫蠟、阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性、抗原修復(fù)和封閉，采用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色。實(shí)驗(yàn)中采用PBS代替一抗作為陰性對照，以脂肪組織的染色結(jié)果作為陽性對照。結(jié)果判定：瘦索及其受體表達(dá)陽性物質(zhì)位于細(xì)胞內(nèi)，陽性結(jié)果為棕黃色。每張切片隨機(jī)選取纖維環(huán)區(qū)域10個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的陽性細(xì)胞數(shù)，再將10個(gè)高倍鏡視野細(xì)胞數(shù)相加，得出每個(gè)樣本陽性纖維環(huán)細(xì)胞數(shù)。
　　1.2.3 纖維環(huán)細(xì)胞培養(yǎng) 椎間盤標(biāo)本取自25歲男性腰椎間盤突出癥病人，在離體30 min內(nèi)取回實(shí)驗(yàn)室。仔細(xì)分離出纖維環(huán)組織， 把纖維環(huán)組織剪成1 mm大小的碎塊，用胰蛋白酶及膠原酶消化后，細(xì)胞用HAMF?12培養(yǎng)液沖洗3次，低速離心5 min，計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞爬片行蘇木精?伊紅染色，見細(xì)胞為梭形或多角形，胞核卵圓形，胞漿淡染。然后進(jìn)行瘦素檢測：40 g/L多聚甲醛固定10 min;PBS沖洗3次，每次3～5 min;2 g/L TritonX?100透化，室溫5 min;PBS沖洗3次，每次3～5 min;封閉液阻斷，室溫60 min;PBS沖洗3次，每次3～5 min;滴加兔抗人瘦素一抗，37 ℃ 1 h;PBS沖洗3次，每次3～5 min;滴加山羊抗兔IgG抗體，37 ℃ 30 min;PBS沖洗3次，每次3～5 min;滴加HRP，37 ℃ 30 min;PBS沖洗3次，每次3～5 min;DAB顯色15 min，封片，觀察。同法檢測瘦素受體。
　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　所測數(shù)據(jù)采用±s表示, 以微軟公司Excel 2000 Student test作樣本均數(shù)t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2 結(jié) 果
　　2.1 蘇木精?伊紅染色
　　退變組椎間盤組織表現(xiàn)為膠原纖維增多，排列紊亂，血管組織浸潤，纖維環(huán)板層狀結(jié)構(gòu)破壞，肉芽組織形成。正常組均表現(xiàn)為纖維環(huán)板層狀結(jié)構(gòu)明顯，軟骨細(xì)胞多見，且較均勻，基質(zhì)較少。
　　2.2 瘦素及其受體在椎間盤組織表達(dá)
　　正常椎間盤組織，瘦素在纖維環(huán)中表達(dá)較均勻，從纖維環(huán)外層向內(nèi)層表達(dá)逐漸減弱，而在髓核的軟骨樣細(xì)胞中無表達(dá);退變椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞中瘦素表達(dá)增強(qiáng)，且不均勻，以細(xì)胞簇及纖維軟骨細(xì)胞增生的區(qū)域明顯，髓核細(xì)胞無表達(dá)。瘦素受體的表達(dá)情況與瘦素相似。退變組與正常組比較差異有顯著意義(t=3.223、5.553，P<0.05)，見表1�！　”�1 兩組瘦素及其受體的表達(dá)情況
　　2.3 瘦素及其受體在體外纖維環(huán)細(xì)胞中的表達(dá)
　　體外培養(yǎng)的纖維環(huán)細(xì)胞中可以檢測到瘦素及其受體的表達(dá)，位于細(xì)胞漿內(nèi)。
　　3 討 論
　　人群中椎間盤退變現(xiàn)象相當(dāng)普遍。退變椎間盤的組織學(xué)特點(diǎn)包括髓核脫水，糖蛋白降解，纖維環(huán)的板層狀結(jié)構(gòu)破壞等。椎間盤蛻變的危險(xiǎn)因素包括吸煙、飲酒、遺傳因素、過勞、糖尿病、高血壓等，這些因素導(dǎo)致了椎間盤細(xì)胞代謝水平的改變，干擾椎間盤細(xì)胞增殖與凋亡的平衡[3]。使得椎間盤中一些炎性遞質(zhì)過表達(dá)，影響椎間盤的修復(fù)能力。最終導(dǎo)致椎間盤蛻變。
　　近來肥胖與椎間盤退變的關(guān)系備受關(guān)注，大量研究證明肥胖在椎間盤退變過程中發(fā)揮作用。但肥胖促進(jìn)椎間盤退變的確切機(jī)制尚不清楚，純機(jī)械應(yīng)力因素難以解釋肥胖與椎間盤蛻變之間的關(guān)聯(lián)。瘦素作為一種脂肪因子于1994年發(fā)現(xiàn)，繼而瘦素的作用被廣泛研究。瘦素通過與中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍器官的瘦素受體直接結(jié)合來調(diào)節(jié)體內(nèi)的能量平衡、脂肪代謝及某些內(nèi)分泌功能，并可能參與了骨與軟骨的發(fā)育過程[4]。瘦素受體是一單跨膜的細(xì)胞表面受體，它至少由5種異構(gòu)形式，其中只有長型受體OB?Rb具備完整的胞內(nèi)區(qū)而具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，它屬于Ⅰ級細(xì)胞因子受體家族，可以激活酪氨酸蛋白激酶家族的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子，故稱為功能性受體。瘦素受體在大腦脈絡(luò)叢、下丘腦、肝臟、胰臟、肺臟、腎臟、關(guān)節(jié)軟骨等多個(gè)部位均有表達(dá)[5]，此與瘦素具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn)，瘦素是一種有絲分裂促進(jìn)劑。它能夠顯著促進(jìn)T淋巴細(xì)胞、角朊細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞的生長增殖。瘦素還具有抗T細(xì)胞、單核細(xì)胞、成神經(jīng)瘤細(xì)胞、海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡作用[6]。同時(shí)，瘦素作為一種細(xì)胞因子樣激素在免疫系統(tǒng)中所發(fā)揮的作用越來越受到關(guān)注。它可為血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的生成提供增殖信號，活化單核細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞，調(diào)節(jié)T、B細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，促進(jìn)細(xì)胞因子的合成，刺激炎性反應(yīng)，而且作為一種新型的免疫調(diào)節(jié)因子，瘦素在多種自身免疫病中也發(fā)揮重要作用。
　　目前認(rèn)為椎間盤退變的關(guān)鍵因素為椎間盤在纖維環(huán)反復(fù)損傷后引起損傷修復(fù)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞聚集，釋放大量的細(xì)胞因子，使椎間盤內(nèi)的細(xì)胞增生和分化，血管、神經(jīng)和纖維沿撕裂的纖維環(huán)裂隙長入，最終導(dǎo)致椎間盤退變。組織學(xué)上病理椎間盤中存在自纖維環(huán)外層到內(nèi)層的肉芽組織條帶區(qū)，對應(yīng)于腰椎間盤造影術(shù)顯示的裂隙。正常椎間盤僅纖維環(huán)表層有血管分布，這些肉芽組織條帶區(qū)最可能起源于外層纖維環(huán)的機(jī)械性創(chuàng)傷和隨之的創(chuàng)傷修復(fù)過程。
　　瘦素可直接參與創(chuàng)傷組織的修復(fù)過程，其與促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)上的相似性提供了瘦素可能參與創(chuàng)傷愈合反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，瘦素調(diào)控血管生成及免疫反應(yīng)的外周作用也與創(chuàng)傷愈合過程關(guān)系密切[7]。 MURAD等[8]認(rèn)為，瘦素由于在組織修復(fù)時(shí)促進(jìn)了新血管的生成從而參與了傷口組織修復(fù)的調(diào)控。他們發(fā)現(xiàn)不僅肉芽組織中的免疫細(xì)胞及修復(fù)細(xì)胞有瘦素受體的表達(dá)，而且皮膚組織受損后傷口中的細(xì)胞就積極參與瘦素的合成，說明瘦素是創(chuàng)傷愈合過程的自分泌或旁分泌調(diào)節(jié)物。 本研究中體外培養(yǎng)的纖維環(huán)細(xì)胞中同時(shí)檢測到瘦素及其受體的表達(dá)，提示椎間盤細(xì)胞生長增殖過程中可能存在自分泌或旁分泌機(jī)制。

退變椎間盤細(xì)胞比正常椎間盤細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)能產(chǎn)生更多的化學(xué)因子，說明椎間盤退變存在炎癥反應(yīng)機(jī)制[9?10]。瘦素作為一種新型的免疫調(diào)節(jié)因子[11]，很有可能參與椎間盤退變過程。有研究表明，瘦素能活化單核?巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其產(chǎn)生促炎因子，增強(qiáng)致炎細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子以及白細(xì)胞介素?6的致炎作用，并且抑制T細(xì)胞向Th細(xì)胞的轉(zhuǎn)化而表達(dá)白細(xì)胞介素?2，從而發(fā)揮其促炎作用，瘦素還可以誘導(dǎo)Th細(xì)胞分化和活化，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素?2、腫瘤壞死因子?d和白細(xì)胞介素?18的合成分泌[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，瘦素系統(tǒng)在退變椎間盤中的表達(dá)強(qiáng)度與正常椎間盤相比明顯增強(qiáng)，表達(dá)分布情況又以參與纖維環(huán)損傷修復(fù)形成的細(xì)胞簇區(qū)域?yàn)橹�，因此我們推測瘦素系統(tǒng)很有可能參與了椎間盤蛻變過程。
　　綜上所述，椎間盤組織中有瘦素系統(tǒng)的表達(dá)，蛻變椎間盤組織中瘦素表達(dá)的程度與模式均與正常椎間盤有明顯差異，并且體外培養(yǎng)的細(xì)胞同時(shí)檢測到瘦素及其受體的表達(dá)。提示瘦素系統(tǒng)很有可能通過自分泌或旁分泌機(jī)制參與了椎間盤蛻變過程。瘦素系統(tǒng)有可能成為椎間盤退變生物學(xué)治療新的靶點(diǎn)。
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