關(guān)于高良姜藥材中4種有效成分的含量測定
【摘要】 目的 建立評價高良姜藥材質(zhì)量的含量測定方法。方法 采用DiamonsilTMC18柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流動相為乙腈?0.2%磷酸溶液，梯度洗脫，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為220 nm。結(jié)果：高良姜素、山柰素?4′?甲醚、5?羥基?7?(4?羥基?3?甲氧苯基)?1?苯?3?庚酮、5?羥基?1,7?雙苯?3?庚酮的線性范圍分別為0.267～1.328 μg、0.103 4～0.517 μg、0.310 8～1.554 0 μg、0.247 3～1.236 μg，平均回收率分別為100.9%、97.0%、96.8%、99.0%，RSD值分別為1.7%、1.4%、1.8%、0.6%。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、簡便，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可用于高良姜藥材的質(zhì)量控制。
【關(guān)鍵詞】 高良姜;高效液相色譜法;黃酮;庚烷;質(zhì)量控制
Abstract:Objective To develop an HPLC method for characterizing the active constituents, namely, galangin, kaempferol?4?methyl ether, diphenylheptane A and diphenylheptane C, in Alpinia officinarum Hance. Method Samples were analyzed on an HPLC Diamonsil C18 column(200 mm×4.6 mm，5 μm) by using gradient elution of acetonitrile (A) and 0.2% aqueous phosphoric acid (B) at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The diode?array detection was set at 220 nm. Results Galangin, kaempferol?4?methyl ether, diphenylheptane A and diphenylheptane C had good linearity over the ranges of 0.267-1.328，0.1034-0.517， 0.3108-1.554 and 0.2473-1.236 μg， respectively, and the average recoveries were 100.9%(RSD=1.7%)、97.0%(RSD=1.4%)，96.8% (RSD=1.8%) and 99.0%(RSD=0.6%)，respectively.ConclusionThe method is rapid，accurate and reproducible, which is helpful in the quality control of Alpinia officinarum Hance.
Key words:Alpinia officinarum Hance;HPLC;flavonoids;diarylheptanoids;quality evaluation
高良姜為姜科山姜屬植物高良姜Alpinia officinarum Hance的干燥根莖，其性熱味辛，歸脾、胃經(jīng),具溫胃散寒、消食止痛的功效，用于脘腹冷痛、胃寒嘔吐、噯氣吞酸等[1]。高良姜黃酮和庚烷均具有調(diào)節(jié)鈣離子釋放、抗氧化應(yīng)激、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗病原微生物、抑制平滑肌刺激收縮、鎮(zhèn)痛止嘔等藥理作用[2～5]。高良姜含有十多種黃酮類成分[6]和十多種二苯基庚烷類物質(zhì)[7]，其中高良姜素、山柰素?4′?甲醚、5?羥基?7?(4?羥基?3?甲氧苯基)?1?苯?3?庚酮 (DPHA)、5?羥基?1,7?雙苯?3?庚酮 (DPHC)含量比較高，因此本文選擇這4個成分作為監(jiān)控指標(biāo)，采用HPLC法同時測定不同批號和來源的高良姜藥材中的以上的2種黃酮類成分和2種庚烷類成分的含量，為全面準(zhǔn)確控制藥材質(zhì)量提供了可行的依據(jù)。
1、儀器、試劑與材料
Waters2695/2996高效液相色譜儀，Empower工作站; BP210D型電子分析天平(德國Sartorius公司);高良姜素對照品、山柰素?4′?甲醚對照品、DPHA、DPHC對照品均為自制，經(jīng)UV、NMR、MS確定化合物結(jié)構(gòu)，以HPLC法按面積歸一化法計，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.0%;乙腈(色譜純);超純水;高良姜藥材為各地收集的市售產(chǎn)品，經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥鑒定教研室王鳳云老師鑒定均為姜科植物高良姜的根莖。
2、方法與結(jié)果
2.1 溶液的制備
2.1.1 對照品溶液的制備
分別精密稱取高良姜素、山柰素?4′?甲醚、DPHA、DPHB、DPHC對照品，加甲醇制成每1 mL含1.068、0.414、1.243、0.248、0.989 mg的對照品儲備液。分別精密量取上述對照品儲備液各1 mL，置20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，制成對照品溶液。
2.1.2 供試品溶液的制備
取不同批號的高良姜藥材細(xì)粉約0.2 g，精密稱定，加甲醇約40 mL回流提取2 h，放冷，過濾，濾液加甲醇定容至50 mL。搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。
2.2 色譜條件
廣東藥學(xué)院學(xué)報，2008，24(5)第5期 陳平,等.高良姜藥材中4種有效成分的含量測定 色譜柱：Diamonsil TMC18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5 μm);流動相：乙腈(A)?0.2%磷酸水(B)，梯度洗脫[0～30 min，A?B(39∶42);30～35 min，A?B(45∶55)]，檢測波長：220 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：20 μL。
2. 3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗
分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各20 μL注入液相色譜儀，計算理論板數(shù)及分離度，結(jié)果見表1、圖1、圖2。
2.4 線性關(guān)系的考察
分別精密吸取對照品溶液5、10、15、20、25 μL注入液相色譜儀，按“2.2”色譜條件測定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。表1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗結(jié)果
成分線性方程r線性范圍/μg高良姜素Y=4.0×106 X+5.1×1040.999 80.267 0～1.328 0山柰素?4′?甲醚Y=4.0×106X+2.5×1040.999 90.103 4～0.517 0DPHAY=2.0×106X+2.0×1040.999 90.310 8～1.554 0DPHCY=8.2×105X+4.7×1030.999 40.247 3～1.236 0
2.5 重復(fù)性試驗
取高良姜藥材細(xì)粉(批號20080315)約0.2 g，精密稱定，共6份，按“2.1.2”項下的方法制備供試品溶液后，按“2.2”色譜條件下測定各組分的含量，結(jié)果高良姜素、山柰素?4′?甲醚、DPHA、DPHC的RSD值(n=6)分別為0.92%、1.60%、0.45%、1.8%，表明方法重現(xiàn)性良好。
2.6 穩(wěn)定性試驗
取供試品溶液(批號20080315)1份，分別間隔4、12、24、36、48 h進(jìn)樣，連續(xù)測定2 d，計算含量，結(jié)果高良姜素、山柰素?4′?甲醚、DPHA、DPHC的RSD值(n=6)分別為0.71%、1.51%、1.7%、1.9%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定。
2.7 加樣回收率試驗
取高良姜藥材粉末(批號20080315)約0.1 g，共6份，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入“2.1.1”項下的高良姜素、山柰素?4′?甲醚、DPHA、DPHC對照品儲備液溶液各1 mL，按“2.1.2”項下方法制備溶液，按“2.2”項色譜條件操作并計算，結(jié)果見表3。 表3 回收率試驗結(jié)果
2.8 樣品測定
對11批樣品按上述方法進(jìn)行含量測定，以外標(biāo)法計算高良姜中各成分的含量。結(jié)果見表4。表4 樣品中的4種成分的含量
3、討 論
3.1 提取方法的選擇
比較了超聲提取法、索氏提取法和回流提取法對藥材中各成分的提取效果，并對不同的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)回流提取法對兩類成分的提取效果最好，操作簡單，因此選用回流提取法提取高良姜藥材制備供試品溶液。
3.2 測定波長的選擇
PAD檢測器全波長掃描發(fā)現(xiàn)，DPHA在220 nm和285 nm均有較大吸收峰，但是DPHC僅在220 nm處有最大吸收峰，高良姜素和山柰素?4′?甲醚在267 nm和360 nm處有較大吸收峰，在220 nm處也有末端吸收。所以選擇220 nm作為測定波長，在無PAD檢測器的條件下也可以應(yīng)用該法，便于推廣。
3.3 色譜柱和流動相的選擇
比較了DiomonsilTM C18柱、WatersTM C18柱和XterrexTM C18柱3種色譜柱的保留行為，發(fā)現(xiàn)WatersTM C18柱保留時間過長，XterrexTM C18柱對黃酮類物質(zhì)存在嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，而DiomonsilTM C18柱適用范圍廣，分離效果好，保留時間相對較短，所以選擇DiomonsilTM C18柱。同時考察了甲醇?水、乙腈?水、乙腈?磷酸溶液、甲醇?磷酸溶液體系等，最終選用0.2%磷酸溶液?乙腈體系進(jìn)行梯度洗脫，取得較好峰形和較高的理論塔板數(shù)，效果滿意。
3.4 指標(biāo)成分的確定
7?(4′?羥基?3′?甲基苯基)?1?苯庚基?4?烯?3?酮(DPHB)是高良姜中二苯基庚烷類物質(zhì)中的一種成分，藥理作用與DPHA和DPHC的藥理作用相似， 但因其含量較低，不作為考察指標(biāo)，所以未進(jìn)行該成分的方法學(xué)考察和藥材中的含量測定。
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